川牛膝不同組分體內(nèi)抗凝血活性研究

孟憲群，梁珊珊，趙奕，王秋紅，匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

現(xiàn)今人們生活水平日益提高,飲食也不斷的豐富，而豐富的飲食里含有大量高脂蛋白的物質(zhì)，導(dǎo)致血栓患者不斷加多[1-2]。治療血栓的主要方法之一是采用抗凝血藥物，但抗凝血藥物也有一定副作用，例如容易使血小板減少[3-4]，因此急需要研究和開發(fā)安全有效的抗凝血藥物。提取天然產(chǎn)物中具有抗凝血作用的有效成分，是研究抗凝藥物的研究熱點(diǎn)，具有周期短、成本低并且低毒的優(yōu)點(diǎn)[5]。

川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)為莧科植物的干燥根，為著名川產(chǎn)道地藥材。川牛膝藥物最早在《仙授理傷續(xù)斷秘方》中出現(xiàn)，具活血化瘀之功效[6-7]。由于其具有鎮(zhèn)痛，免疫增強(qiáng)劑，抗腫瘤，抗炎，抗炎等多種藥理活性，已被列入《中華人民共和國(guó)藥典》[8]。川牛膝多糖是從川牛膝的根中提取的一種生物活性多糖，具有低毒、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血糖、抗衰老、促進(jìn)紅細(xì)胞免疫功能[9]、抗腫瘤、減輕環(huán)磷酞胺Cy所致外周白細(xì)胞減少等功能[10-11]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)川牛膝多糖抗凝血活性還未有研究報(bào)道。因此，本文以川牛膝為原料，提取川牛膝多糖，研究水和不同濃度乙醇提取的粗多糖對(duì)小鼠全凝血時(shí)間(CT)、出血時(shí)間(BT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APPT)、凝血酶時(shí)間(TT)和纖維蛋白原(FIB)的影響，探討川牛膝多糖對(duì)體內(nèi)抗凝血的作用，為川牛膝的藥理活性開發(fā)和應(yīng)用提供更多開發(fā)的可能性。

1 材料與方法

1.1 試藥

川牛膝在黑龍江省哈爾濱市藥材公司采購(gòu)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源學(xué)教研室王振月教授鑒定為莧科植物川牛膝的干燥根。

1.2 動(dòng)物

ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，合格證號(hào)SYXK(黑)2016001，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評(píng)價(jià)中心提供。

1.3 試劑

凝血酶時(shí)間(TT試劑8×4.0 ml，北京普利生儀器有限公司，批號(hào)1520908011)；凝血酶原時(shí)間(PT試劑10×4.0 ml，北京普利生儀器有限公司，批號(hào)163201022)；活化部分凝血酶時(shí)間(APTT試劑5×4 ml，北京普利生儀器有限公司，批號(hào)152801022)；纖維蛋白原(FIB試劑4×5.0 ml，北京普利生儀器有限公司，批號(hào)162802011)；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛明儀器有限公司)；C2000-A高性能血凝儀(普利生集團(tuán))；ALPHA 1-4 LD plus型冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Martin Christ 公司)；UV-1601型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；KQ-500DB型超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.5 川牛膝粗多糖的制備

稱量1 kg的川牛膝粗粉，用水、20%乙醇、50%乙醇作為提取劑，浸泡至過夜，采用回流法提取，共3次，60 min/次，獲得的提取液過濾，之后合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，冷卻后，加入乙醇進(jìn)行醇沉，使乙醇終濃度是80%，在4℃下放24 h，3 000 r/min離心10 min，多糖沉淀，在低溫的情況下使溶劑揮干，干燥多糖。通過苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，葡萄糖為對(duì)照品，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定多糖的含量[12]。結(jié)果水提多糖66.9%、20%乙醇提多糖53.9%、50%乙醇提多糖39.7%。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

ICR的小鼠70只，分為10組，每組7只，分別為水提取川牛膝多糖高、中、低劑量組，20%乙醇和50%乙醇提取的粗多糖高、中、低劑量組和空白組。將川牛膝粗多糖配成16、8、4 g/kg濃度，小鼠按高、中、低劑量灌胃，空白組小鼠給予同體積生理鹽水，連續(xù)3 d。

1.7 小鼠全凝血時(shí)間(clotting time，CT)的測(cè)定

最后一次給藥1 h后，CT測(cè)定利用玻片法，而且是每組7只小鼠都進(jìn)行測(cè)定[13-14]。在小鼠尾尖3 mm處橫剪斷并且在載玻片上，滴直徑為5 mm的血滴， 馬上用秒表記錄時(shí)間，每一個(gè)10 s就用清潔的針頭從血滴邊緣向里輕輕挑起一次，觀察有無血絲被挑起，從采血開始到挑起血絲為止，所需要的時(shí)間即為CT。

1.8 小鼠出血時(shí)間(BT)的測(cè)定

腹腔注射大約20 min后，在小鼠尾尖3 mm切斷，當(dāng)有血流出時(shí)刻，開始用秒表計(jì)時(shí)并且每隔30 s，用濾紙?jiān)谖布鈾z測(cè)1次血滴，沒有血溢出為止，記錄BT[14]。

1.9 凝血4項(xiàng)的測(cè)定

小鼠最后給藥的1 h后，取血，精密量全血0.9 mL并且馬上加抗凝劑，放到離心管，混勻后3 000 r/min離心15 min，需在4 h內(nèi)按照試劑盒說明書測(cè)定PT、APTT、TT和FIB值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

由表1可知，水和20%乙醇提取川牛膝粗多糖具有明顯抗凝血效果，在高劑量組和空白組的比較發(fā)現(xiàn)水提取的粗多糖抗凝血的效果最好(P<0.01)。表2和表3測(cè)定的凝血4項(xiàng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)水和20%乙醇提取粗多糖，高劑量組與空白組比較能明顯延長(zhǎng)CT、BT、APTT和TT時(shí)間，F(xiàn)IB值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，對(duì)PT值無顯著影響。但是高、中、低劑量組的50%乙醇提取的粗多糖對(duì)CT、BT、PT、APTT和TT延長(zhǎng)作用不明顯，也無降低FIB的作用。川牛膝水和20%乙醇、50%乙醇提取的粗多糖抗凝血活性測(cè)定結(jié)果見表1～3。

表1 體內(nèi)抗凝血活性檢測(cè)結(jié)果

注：與空白組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

表2 川牛膝多糖對(duì)小鼠的APTT，PT，TT的影響

注：與空白組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

表3 川牛膝多糖對(duì)小鼠的FIB的影響

注：與空白組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

3 討論

川牛膝具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)的作用，可以防治血管內(nèi)栓塞或血栓形成的疾病，預(yù)防中風(fēng)等[15]。檢測(cè)抗凝活性的前提條件是凝血時(shí)間(CT)和出血時(shí)間(BT);而APTT常用來檢測(cè)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)和篩選實(shí)驗(yàn);PT通常用來測(cè)定外源性凝血系統(tǒng)的一種理想并且經(jīng)常使用的篩選試驗(yàn);TT是鑒定纖維形成的一種實(shí)驗(yàn)方法;FIB纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)[16-17]。因此利用這六項(xiàng)指標(biāo)來探討川牛膝粗多糖是否具有體內(nèi)抗凝血的作用。通過水、20%乙醇、50%乙醇提取，乙醇醇沉之后的粗多糖得率分別為21.3%、15.6%、12.3%。通過苯酚硫酸法測(cè)定多糖的含量結(jié)果水提粗多糖66.9%、20%乙醇提粗多糖53.9%、50%乙醇提粗多糖39.7%。由結(jié)果來看水提取的多糖含量是最高的，并且川牛膝水提取的粗多糖能顯著延長(zhǎng)CT、BT、APTT和TT時(shí)間，降低FIB值，并且隨著濃度的加大，效果越加明顯,但是對(duì)PT無明顯的影響。20%乙醇提取的粗多糖也可以使CT、BT、APTT和TT時(shí)間延長(zhǎng)，降低FIB值，PT無明顯的影響，同樣具有濃度依賴性,但是不如水提取的粗多糖效果好。APTT和TT的時(shí)間被延長(zhǎng)說明川牛膝水提取和20%乙醇提取的粗多糖在體內(nèi)起到抗凝作用的途徑是通過使內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑被激活完成的。與以前報(bào)道其他多糖抗凝血作用機(jī)制相似[18-20]。降低了FIB的時(shí)間，說明川牛膝多糖體內(nèi)抗凝與血漿蛋白原有關(guān)聯(lián)。而高、中、低劑量組50%乙醇提取的多粗糖對(duì)CT、BT、PT、APTT、TT延長(zhǎng)作用不明顯，也沒有降低FIB值,表明50%提取粗多糖不具有抗凝活性。

本次實(shí)驗(yàn)首次以川牛膝作為原材料，用水和乙醇作為提取溶劑得到提取物，來初步判斷不同溶劑和濃度提取的川牛膝多糖在體內(nèi)抗凝血效果，通過苯酚硫酸法測(cè)定不同溶劑和濃度提取的川牛膝多糖，發(fā)現(xiàn)水提取的川牛膝多糖含糖量是最高的，并且也是體內(nèi)抗凝效果最好。但水提取的多糖盡管含多糖量最高，但是也會(huì)把一些蛋白類、皂苷類等一些物質(zhì)提取出來，所以川牛膝多糖是否為體內(nèi)抗凝血活性成分還有待進(jìn)一步研究。

[1] 程曉昱,姚淮芳,王健平,等.中藥降脂靈與血脂康治療高脂血癥對(duì)比研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2002,11(2):88-89.

[2] 張清安,范學(xué)輝,陳錦屏.紅棗汁對(duì)小鼠血脂水平影響的研究[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然版),2004,32(2):77-79.

[3] EKANAYAKE P M,NIKAPITIYA C,ZOYSA M D,et al.Novel anticoagulant compound from fermented red alga Pachy-meniopsis elliptica[J].European Food Research and Technology,2008,227:897-903.

[4] 田建明,宋麗晶,李浩,等.人參皂苷Rg2對(duì)大鼠體內(nèi)血栓形成及血小板聚集的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志,2009,43(11):79-80.

[5] 周永國(guó),楊越冬,王樹元,等.天然活性多糖在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展[J].高分子通報(bào),2006(9):16-23.

[6] 藺道人.仙授理傷續(xù)斷秘方[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1957:78.

[7] 李時(shí)珍.本草綱目[M].點(diǎn)校本上冊(cè).北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:10281.

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:35-36.

[9] FENG H B,DU X G,et al.Enhancement of the immune responses to foot-and-mouth disease vaccination in mice by oral administration of a Novel polysaccharide from the roots of Radix Cyathulae officinalis Kuan (RC)[J].J CELL IMMUNOL,2013,281:111-121.

[10] CHEN H,LIU Y P.The element anti-tumour research of Cyathula officinalis Kuan Polysaccharide[J].J ChengDu Unw TCM,2001,24(1):49-50.

[11] 李祖?zhèn)?石圣洪,陳紅,等.川牛膝多糖促紅細(xì)胞免疫功能研究[J].中藥藥理臨床,1999,15(4):26-27.

[12] DUBOIS M,GILLES K A,HAMILTON J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1956,28,350-356.

[13] WANG J P. Antihemostatic and antithrombotic effects of capsaicin in comparison with aspirin and indomethacin[J].Thromsis Res,1985,37 (2):669-670.

[14] 何亞琴，何群峰，趙虞文，等.腸寧方灌腸聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)潰瘍性直腸炎患者炎癥因子及凝血功能的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2017，22(7)：805-809.

[15] 陳幸,黎萬壽,梁溢,等.川牛膝化學(xué)成分的鑒定[J].中草藥,2004,35(9):978-979.

[16] 張彥麗,張碩峰,華國(guó)棟,等.紅花對(duì)華法林抗凝作用的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(1):32-35.

[17] 蘇東,桂滿元,王永娜,等.EDTA-K2抗凝血對(duì)生化檢驗(yàn)結(jié)果的影響及校正方法分析[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2015,12(7):74-76.

[18] 林長(zhǎng)征,管華詩,裴渭靜,等.藻酸雙酯鈉的超濾分級(jí)及分級(jí)產(chǎn)物抗凝血活的比較研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2007,42(22):1689-1692．

[19] 張喆邇,劉雪蓮,楊靖亞,等.羊棲菜硫酸多糖的抗凝血活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(18):7505-7508.

[20] 趙銳,郭彩霞,張鷗,等.玉米芯多糖及其硫酸酯抗凝血活性及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,18(1):62-66.