酒精對(duì)丙酸睪酮誘導(dǎo)的小鼠前列腺增生的作用*

蘆春斌， 仇平樂， 孔綺君， 朱倍倍， 李春夢(mèng)， 劉 標(biāo)

(1. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生殖免疫研究所， 廣東 廣州 510632； 2. 環(huán)境保護(hù)部 南京環(huán)境科學(xué)研究院， 江蘇 南京 210042)

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)是中老年男性中最常見的退行性疾病，40歲以上男性患病率為50%左右，60歲以上男性幾乎全部患有不同程度的前列腺增生[1]。良性前列腺增生會(huì)增加患下尿路綜合征和膀胱出口梗阻的風(fēng)險(xiǎn)[2]，而且會(huì)導(dǎo)致生殖功能障礙[3]，影響患者生育力，對(duì)前列腺增生的研究是男性學(xué)研究的重要內(nèi)容。前列腺增生的發(fā)病原因較復(fù)雜，其具體機(jī)制尚不完全清楚，目前已知雄激素在BPH發(fā)病過程中起著重要作用[4]。類固醇激素睪酮(testosterone)在男性的睪丸中合成，其與雄激素受體共同影響著雄性的精子發(fā)生和功能[5]，血液中過多的睪酮會(huì)抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)睪酮的生成，從而影響精子發(fā)生和睪丸生長，使精子數(shù)量降低[6]。前列腺的生長發(fā)育主要利用血液中的睪酮，在前列腺中5-α還原酶能將睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮。雙氫睪酮的活性是睪酮的2～3倍[7]。 雙氫睪酮在前列腺增生中起主要作用，其可通過結(jié)合雄激素受體(androgen receptor ，AR)促進(jìn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)和表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)的表達(dá)，從而使前列腺上皮細(xì)胞增殖[8]，形成前列腺增生。所以睪丸是否正常也決定前列腺的正常發(fā)育與功能。

除了睪酮外，包括酒精攝入等多種因素可能影響睪丸的生理功能和前列腺的發(fā)育。一些研究表明，酒精會(huì)誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激，其可能使睪丸組織受損，對(duì)生精細(xì)胞造成殺傷，使精子數(shù)量和質(zhì)量下降[9]。臨床上，在BPH治療期間飲酒會(huì)影響前列腺增生組織中睪酮的清除[10]。有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)[11]，飲酒與良性前列腺增生的發(fā)病率呈正相關(guān)。這些研究提示飲酒對(duì)前列腺增生的發(fā)生和發(fā)展可能有促進(jìn)的作用，同時(shí)還有可能對(duì)睪丸生精功能產(chǎn)生影響，然而目前酒精攝入對(duì)前列腺增生組織發(fā)展作用的研究還不多。

本研究通過皮下注射丙酸睪酮或同時(shí)酒精灌胃來誘導(dǎo)小鼠BPH，研究飲酒對(duì)小鼠前列腺增生的作用及睪丸的生理變化，并檢測(cè)前列腺和睪丸中的脂質(zhì)過氧化物及抗氧化酶的變化，為進(jìn)一步研究前列腺增生的發(fā)病機(jī)制，以及飲酒對(duì)男性生殖健康的影響提供依據(jù)，并為前列腺增生病或生殖損傷的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明系小鼠70只，5～6周齡，SPF級(jí)，體重25±2 g，購于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。小鼠按照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，室溫22～24℃，室內(nèi)濕度40%～70%，光照時(shí)間為12 h/d。動(dòng)物的飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)處理、處死符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)規(guī)范。

1.2 儀器及材料

紫外可見分光光度計(jì)(UV7500，上海天美科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Elx800，美國Bio Tek公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司，EX200)；丙酸睪酮注射液(25 g/L)購自寧波第二激素廠(批號(hào)110251054)，白酒為市售的紅星二鍋頭酒(乙醇含量50%)，HE染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，其余試劑均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立

70只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CON，21 d無處理)、陰性對(duì)照組( NC, sc,大豆油25 mg/(kg·d)，ig,蒸餾水7.5 ml/(kg·d),連續(xù)處理21 d)、酒精7 d和酒精21 d組(AL7和AL21，ig 50°白酒 7.5 ml/(kg·d)，連續(xù)處理7 d和21 d)，丙酸睪酮7 d和丙酸睪酮21 d組(TP7和TP21，sc,丙酸睪酮注射液 25 mg/(kg·d)，連續(xù)處理7 d和21 d)，丙酸睪酮+酒精7 d組(TP+AL7，sc 丙酸睪酮注射液 25 mg/(kg·d)、oral 50°食用白酒 7.5 ml/(kg·d)，連續(xù)處理7 d)7組，每組10只。(預(yù)實(shí)驗(yàn)中用相同劑量的TP+AL共同連續(xù)處理21 d后，生殖檢測(cè)的部分指標(biāo)，如精子數(shù)量畸形率低于檢測(cè)線，小鼠死亡率超過50%，故沒有設(shè)置TP+AL21 d組)丙酸睪酮注射液用大豆油稀釋的，所灌胃的酒精劑量根據(jù)2007年《中國居民膳食指南》的定義，相當(dāng)于成人每日適度飲酒量的8倍，即為過度飲酒劑量。在末次給藥24 h后，稱重，脫頸處死小鼠，分離前列腺、睪丸組織稱其濕重，計(jì)算前列腺和睪丸臟器系數(shù)(臟器指數(shù)=臟器濕重mg /小鼠體重g)，并將前列腺組織置于Bouins固定液中。

1.4 前列腺組織光鏡標(biāo)本制備

處死小鼠取前列腺，Bouins固定液固定24 h后，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。切片厚度5 mm，HE染色并中性樹膠封片。在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.5 精子數(shù)量檢測(cè)

各組小鼠在末次給藥24 h后，采用脫頸處死，迅速用75%酒精進(jìn)行體表消毒，小心分離兩側(cè)附睪尾，放置在盛有1 ml HTF的35 mm培養(yǎng)皿中，于解剖鏡下用細(xì)針扎破附睪尾中的曲細(xì)精管，將精子擠壓流出，用3層擦鏡紙過濾，制備成精子混懸液。將盛有精子懸液的培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min，取7 ml精子懸液加入在血球計(jì)數(shù)板上在倒置顯微鏡下觀察(20×物鏡)并進(jìn)行精子計(jì)數(shù)。

1.6 精子畸形率檢測(cè)

將80 μl所制備的精子混懸液加入EP管中，再加入20l 1%伊紅溶液充分混勻。靜置染色15 min左右，取染色的精子懸液50 μl于潔凈載玻片上均勻推片，自然干燥后，中性樹膠封片：于光學(xué)顯微鏡下(40×物鏡)隨機(jī)觀察200個(gè)著色精子的形態(tài)，計(jì)算200個(gè)精子中畸形精子：頭部無鉤、香蕉頭、胖頭、尾折疊及雙尾的百分比。

1.7 各組小鼠前列腺及睪丸SOD、GPx活性和MDA含量檢測(cè)

前列腺與睪丸在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗后，用濾紙吸干多余水分，分別稱重。將前列腺或睪丸放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，然后加入9倍體積預(yù)冷的生理鹽水，冰上研磨，制備組織勻漿。充分研磨后，將組織勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中，于4℃冷凍離心機(jī)中 4 000 r/min離心10 min，取上清，即得10%組織勻漿，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需求，可再稀釋成5%和1%的組織勻漿，用于SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測(cè)。

1.7.1 超氧化物歧化酶(SOD) 采用SOD檢測(cè)試劑盒(NO.19160，Sigma-Aldrich，Japan)進(jìn)行SOD活性檢測(cè)，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7.2 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) GSH-Px可催化以GSH(谷胱甘肽)為還原劑的過氧化物還原反應(yīng)，而GSH可與5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反應(yīng)生成黃色的5-硫代,2-硝基苯甲酸陰離子，通過計(jì)算該離子的濃度即可計(jì)算出GSH的減少量，接著求得GSH-Px活力。實(shí)驗(yàn)步驟依照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[12]。

1.7.3 丙二醛(MDA)含量測(cè)定 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA在高溫下可與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在532 nm處有最大吸收峰，可用分光光度法進(jìn)行定量檢測(cè)。依據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[12]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠前列腺及睪丸臟器系數(shù)比較

酒精處理7 d或21 d后，小鼠的前列腺系數(shù)與陰性對(duì)照相比沒有顯著差異(P>0.05)，同樣TP 7 d處理的小鼠前列腺系數(shù)也無顯著性差異(P>0.05)，而21 d TP處理后，發(fā)生典型的BPH、前列腺系數(shù)顯著增高(P<0.05)。AL7/21 d組雖然沒有引起前列腺增生，但是其睪丸系數(shù)與陰性對(duì)照組相比分別降低了10%和24%(P<0.05)；TP7 d組的睪丸系數(shù)與陰性對(duì)照組相比降低了4%(P>0.05)，而TP21處理21 d后睪丸系數(shù)降低了23%(P<0.05)，說明TP或AL處理都會(huì)對(duì)睪丸造成一定程度的損傷且存在時(shí)間依賴性。與陰性對(duì)照組、TP7 d組和AL7 d組相比，21 d TP處理后，不僅小鼠的前列腺系數(shù)明顯增高，其睪丸系數(shù)也明顯降低(P<0.05)，而TP+AL共同處理7 d的小鼠前列腺系數(shù)可達(dá)到TP處理21 d所致的前列腺增生狀態(tài)(表1)，酒精灌胃處理可以明顯促進(jìn)前列腺增生的發(fā)生和進(jìn)程，并對(duì)睪丸造成一定程度的損傷。

Tab. 1 Mice prostate and testis n=10)

CON: Control; NC: Negative control; TP7 and TP21: Testosterone propionate for 7 and 21 days; AL7 and AL21: Alcohol for 7 and 21 days; TP+AL7: Testosterone propionate+alcohol for 7 days

*P<0.05vsnegative control group;#P<0.05vsTP7 group;▲P<0.05vsTP21 group;△P<0.05vsAL7 group;●P<0.05vsAL21 group

2.2 不同處理方式對(duì)小鼠前列腺組織病理學(xué)改變的影響

陰性對(duì)照組小鼠前列腺上皮大多以單層立方或柱狀細(xì)胞構(gòu)成，腺腔規(guī)則，大小比較一致，腔內(nèi)有少量的酸性分泌物(圖1A)。本實(shí)驗(yàn)中TP7 d組、AL7/21 d組小鼠的前列腺病理狀況與空白對(duì)照組小鼠的沒有明顯變化，其前列腺增生病理特征不明顯，表明單獨(dú)TP處理7 d，或AL處理7/21 d不能建立小鼠BPH模型。而TP處理21 d后，可以看到前列腺腔上皮細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的結(jié)節(jié)狀增生，鋸齒樣擴(kuò)張明顯，大部分腺體乳頭向腔內(nèi)突出，腺上皮部分呈高柱狀(圖1，F(xiàn))，同樣TP+AL7d組前列腺增生病理變化也達(dá)到TP處理21 d相似的良性前列腺增生狀態(tài)，TP+AL共同處理建立前列腺增生模型耗時(shí)較短、前列腺增生典型，此建模方法成功可靠。

Fig.1HE staining of different modeling methods of BPH mouse prostate tissue pathological analysis (×100, bar=100 μm)

A： NC(Negative control); B: TP7(Testosterone propionate for 7 days); C: TP21(Testosterone propionate for 21 days); D: AL7(Alcohol for 7 days); E: AL21(Alcohol for 21 days); F: TP+AL7(Testosterone propionate+alcohol for 7 days)； * ： Acid secretion;↑： Glandular epithelial cells

2.3 各組小鼠精子數(shù)量、畸形率檢測(cè)

精子數(shù)量和畸形率是評(píng)價(jià)男性生育力的兩個(gè)重要參數(shù)。TP7/21 d組小鼠的精子數(shù)量較陰性對(duì)照組有所降低(P<0.05)，而其精子畸形率卻沒有顯著性差異，即其處理不會(huì)對(duì)精子質(zhì)量造成明顯影響。AL7 d組小鼠精子數(shù)量較TP7 d組的低，并且精子畸形率比TP7 d組明顯高(P<0.05)，同時(shí)，AL21 d組小鼠精子數(shù)量比TP21 d組的低，精子畸形率也要比TP21 d組的高(P<0.05)，表明AL的處理比TP處理對(duì)精子數(shù)量和畸形率的影響更嚴(yán)重。TP+AL7 d后不僅精子數(shù)量低于其他各組(P<0.05)，精子畸形率除與AL21 d組小鼠相近外，也都明顯高于其它組小鼠(P<0.05, 表2)，表明TP+AL共同處理7 d也對(duì)精子數(shù)量和質(zhì)量都有顯著的損傷作用。

GroupSperm count(×107/ml)Sperm abnormality(%)CON 1.105±0.0764.2±0.1NC1.060±0.0815.0±0.3TP7 0.870±0.056?5.6±1.3TP210.550±0.032?#5.4±1.1AL70.670±0.032?#14.0±1.3?#▲AL210.360±0.022?#▲△24.0±1.5?#▲△TP+AL70.240±0.083?#▲△●22.0±2.1?#▲△

*P<0.05vsnegative control group;#P<0.05vsTP7 group;▲P<0.05vsTP21 group;△P<0.05vsAL7 group;●P<0.05vsAL21 group

2.4 各組小鼠睪丸及前列腺M(fèi)DA、SOD、GPx含量的檢測(cè)

經(jīng)過不同的處理方式和不同處理時(shí)間，AL7 d組小鼠睪丸和前列腺的MDA含量比TP7 d組高，其SOD和GPx含量卻明顯低于TP7 d組(P<0.05)。隨著酒精處理時(shí)間延長，AL21 d組的氧化損傷程度較AL7 d組更加嚴(yán)重，即處理相同時(shí)間酒精造成的氧化損傷要比TP更明顯。TP7 d組的睪丸和前列腺M(fèi)DA含量比TP21 d組的低，其SOD和GPx含量比TP21 d組低(P<0.05)，AL7 d組和AL21組相比也有相似的結(jié)果，說明隨著處理時(shí)間增加單獨(dú)使用TP或AL造成的氧化損傷程度也明顯加重。然而，TP+AL7 d組與TP7/21 d組和AL7/21 d組相比，其睪丸及前列腺增生組織的MDA增高(P<0.05)，同時(shí)，SOD和GPx含量降低(P<0.05)，說明前列腺增生的加重和睪丸精子損傷與酒精攝入后機(jī)體ROS升高，造成氧化應(yīng)激有關(guān)(表3、4)。

GroupMDA(nmol/mg pro)SOD(U/mg pro)GPx(U/mg pro)CON1.23±0.1144.8±3.90.022±0.004NC1.28±0.2143.1±4.10.020±0.007TP72.03±0.30?39.5±1.4?0.015±0.002?TP212.83±0.35?#35.4±2.0?#0.011±0.006?#AL72.40±0.41?34.5±2.1?#0.012±0.004?AL213.18±0.70?#30.5±3.6?#△0.008±0.003?TP+AL74.51±0.53?#▲△●25.0±1.0?#▲△●0.005±0.002#▲△●

*P<0.05vsnegative control group;#P<0.05vsTP7 group;▲P<0.05vsTP21 group;△P<0.05vsAL7 group;●P<0.05vsAL21 group

GroupMDA(nmol/mg pro)SOD(U/mg pro)GPx(U/mg pro)CON1.41±0.1438.5±2.70.19±0.02NC1.42±0.1236.9±3.30.21±0.03TP72.13±0.61?32.6±5.1?0.17±0.02?TP212.72±0.82?#27.5±2.0?#0.12±0.01?#AL72.90±0.50?#26.0±2.1?#0.15±0.05?AL213.79±0.18?△23.0±1.5?△0.04±0.07?△TP+AL75.10±1.02?#▲△●21.0±3.2?#▲△●0.02±0.00?#▲△●

*P<0.05vsnegative control group;#P<0.05vsTP7 group;▲P<0.05vsTP21 group;△P<0.05vsAL7 group;●P<0.05vsAL21 group

3 討論

前列腺是生殖系統(tǒng)重要組成器官，其分泌液是精液的主要成分，對(duì)正常的生殖功能必不可少。前列腺增生是男性退行性疾病，在中年男性中，年齡與發(fā)病率呈正相關(guān)。雄性激素變化與前列腺增生(BPH)密切相關(guān)，其增生不但影響排尿、射精，前列腺病理性增生，對(duì)睪丸中精子發(fā)生與質(zhì)量的影響也不容忽視，其可直接影響前列腺增生患者的生殖功能和生育力。前列腺增生病已成為現(xiàn)代社會(huì)中的一種常見病，并有很多前列腺增生潛在病患在日常生活中存在飲酒或酗酒的情況。酒精對(duì)生殖系統(tǒng)中睪丸的損傷已被證實(shí)，而目前酒精對(duì)BPH發(fā)生及生殖功能損傷的作用研究還很少。故本研究以TP與AL聯(lián)合建模，探討AL對(duì)TP建立的BPH模型小鼠前列腺增生和睪丸的影響。

構(gòu)建BPH動(dòng)物模型是研究BPH的發(fā)生、發(fā)展和防治必不可少的手段。現(xiàn)有的建立BPH模型的方式是在嚙齒動(dòng)物皮下注射丙酸睪酮來誘發(fā)前列腺增生，處理3～4周達(dá)到良性前列腺增生狀態(tài)[12]。然而在本研究中發(fā)現(xiàn)，AL單獨(dú)處理或TP 7 d短期處理都不能造成明顯的前列腺組織增生，而TP與AL共同處理7 d即可發(fā)生典型的BPH，與TP單獨(dú)處理所引發(fā)的前列腺增生模型小鼠相比，TP+AL7 d組的精子質(zhì)量和組織抗氧化能力顯著下降，提示雄激素紊亂引發(fā)的良性前列腺增生對(duì)雄性睪丸功能的影響不顯著，同時(shí)也說明AL對(duì)TP引起的小鼠前列腺增生有明顯的促進(jìn)作用，這與飲酒會(huì)降低睪丸生殖生理功能也有一定的聯(lián)系，加速雄激素在機(jī)體內(nèi)的紊亂，在實(shí)驗(yàn)中也顯示AL降低前列腺增生模型小鼠的精子質(zhì)量和功能。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AL和TP單獨(dú)處理小鼠都能對(duì)前列腺和睪丸造成氧化應(yīng)激損傷，這些氧化應(yīng)激與前列腺增生和精子功能損傷存在一些關(guān)聯(lián)。已有研究報(bào)導(dǎo)，前列腺中睪酮或雙氫睪酮的過度積累會(huì)造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，其能誘導(dǎo)亞胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶的過表達(dá)，其中精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶是多胺代謝途徑中的限速酶，多胺氧化的過程中產(chǎn)生的H2O2可能是前列腺上皮細(xì)胞中高ROS水平及氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要原因[13,14]，同時(shí)酒精在人體中代謝成乙醛的過程中也會(huì)產(chǎn)生過多的ROS[15]，ROS會(huì)與多不飽和脂肪酸反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA，因此MDA 的含量反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的程度，SOD和GPx是細(xì)胞內(nèi)清除超氧產(chǎn)物的關(guān)鍵還原酶[16]，而機(jī)體氧化應(yīng)激的增強(qiáng)會(huì)破壞這一平衡，造成MDA的不斷累積，對(duì)細(xì)胞造成損害。本研究中，TP7 d組小鼠的精子數(shù)量與質(zhì)量、前列腺及睪丸組織的臟器系數(shù)及前列腺病理學(xué)觀察與正常組相比均沒有顯著變化，但是可以從抗氧化能力的變化看出，其組織內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生氧化應(yīng)激，這就說明單獨(dú)使用TP建立的小鼠BPH模型，時(shí)間因素很重要，短期內(nèi)還不能表現(xiàn)出病理狀態(tài)，然而灌胃AL卻起到了促進(jìn)作用，使模型在短期內(nèi)完成，從表3和表4中各項(xiàng)氧化應(yīng)激指標(biāo)可以看出，其原因是AL加劇前列腺和睪丸組織的氧化應(yīng)激，促使組織的病理結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。有研究表明，ROS的增加可能會(huì)導(dǎo)致前列腺組織細(xì)胞中DNA突變，引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，即癌細(xì)胞[17，18]，因此AL在BPH病患體內(nèi)產(chǎn)生的ROS會(huì)加劇前列腺的增生并對(duì)睪丸造成損傷。本研究提示，飲酒會(huì)破壞良性前列腺增生小鼠的睪丸生理功能，導(dǎo)致性腺軸的調(diào)控紊亂，并且加劇機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)BPH發(fā)展，提示過量攝入酒精會(huì)增加患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，但其發(fā)生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。