棘胸蛙虹彩病毒免疫方法研究

胡金春，胡靄臻，金米雪，林威丞，謝夢(mèng)佳，包伊鵬，李 柯，鄭善堅(jiān)*

(1.浙江師范大學(xué)野生動(dòng)物保護(hù)與利用技術(shù)中心，浙江金華 321004；2.浙江省衢州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江衢州 324002)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，又名石蛙，是我國(guó)棘蛙屬中分布最廣的物種之一，主要分布于我國(guó)云南、貴州、安徽、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南、福建、廣東、廣西和香港等地區(qū)[1]。隨著人工養(yǎng)殖的發(fā)展，棘胸蛙病害也逐漸增多，近年來(lái)在浙江麗水等地區(qū)養(yǎng)殖的棘胸蛙出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的蛙病，主要表現(xiàn)出體表腹部充血、頭部和四肢皮膚出現(xiàn)潰爛等癥狀，死亡率高達(dá)90%以上，常規(guī)用藥治療效果不明顯，嚴(yán)重制約了棘胸蛙的養(yǎng)殖發(fā)展。經(jīng)鑒定，病原為虹彩病毒科(Iridovirus)蛙病毒屬(Ranavirus)的種類(lèi)，暫命名為棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)。

虹彩病毒是一類(lèi)感染低等脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的二十面體狀、大型雙鏈DNA病毒，是水生動(dòng)物重要的病毒性病原。蛙病毒最早于20世紀(jì)60年代從蝌蚪期的豹蛙(Ranapipiens)上分離[2]，目前蛙病毒感染呈世界性分布，包括北美、歐洲和亞洲，病毒宿主廣泛，有超過(guò)80種爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物感染蛙病毒的報(bào)道，且大部分病毒對(duì)宿主有較強(qiáng)的致病性和致死性[3-7]。疫苗免疫被認(rèn)為是防治蛙病毒等病毒性性疾病最安全、最有潛力的方法之一[8-9]。棘胸蛙膽小怕驚，捕捉及疫苗注射容易造成其應(yīng)激性損傷及機(jī)械性損傷，體表噴霧免疫操作方便，對(duì)棘胸蛙的應(yīng)激及損傷小，但上述2種免疫方法的免疫效果研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者對(duì)棘胸蛙虹彩病毒疫苗的不同免疫方法進(jìn)行了研究，以期為棘胸蛙等兩棲蛙類(lèi)開(kāi)展疫苗免疫提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1材料棘胸蛙虹彩病毒QSIV由浙江省野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離；健康棘胸蛙，購(gòu)自浙江綠谷清泉石蛙養(yǎng)殖合作社，平均規(guī)格(52.0±3.5)g；EPC細(xì)胞由浙江省淡水水產(chǎn)研究所提供；ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2疫苗制備選擇生長(zhǎng)良好的鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(EPC細(xì)胞)，接種棘胸蛙虹彩病毒QSIV，23 ℃條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞脫落75%以上時(shí)收集病毒，-20 ℃下保存。將所有制備的病毒液混合，采用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度[10]。將病毒液稀釋至1×108TCID50/mL，用0.1% β-丙內(nèi)酯4 ℃下滅活72 h，制備疫苗。

1.3免疫試驗(yàn)免疫前將棘胸蛙隨機(jī)均分為6組，每組20只，分別飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室人工蛙槽中適應(yīng)3 d。①、②、③組為注射組，分別肌肉注射0.2 mL 1×107TCID50/mL、1×108TCID50/mL的疫苗和等劑量的PBS。④、⑤、⑥組為噴霧組，用噴壺將濃度稀釋為1×107TCID50/mL的疫苗噴霧到棘胸蛙的體表皮膚，其中④組僅噴霧1次；⑤組每10 min噴霧1次，連續(xù)噴霧5次；⑥組噴灑純水，噴灑后10 min放回養(yǎng)殖槽。免疫后每隔7 d隨機(jī)取1只棘胸蛙心臟采血1次，共采血4次。將血樣先室溫靜置1 h，4 ℃冰箱中靜置24 h，3 000 r/min離心10 min，取上清用于血清抗體效價(jià)檢測(cè)。

1.4免疫效果評(píng)價(jià)

1.4.1血清抗體效價(jià)檢測(cè)。將疫苗12 000 r/min離心15 min，取上清用包被液稀釋?zhuān)?96孔酶標(biāo)板各孔中加入稀釋過(guò)的抗原100 μL，37 ℃溫箱孵育2 h后，取出甩干各孔包被液，每孔加入封閉液100 μL，37 ℃孵育 1 h后甩干封閉液，用洗滌液洗板2次。將待測(cè)血清用洗滌液從1∶5倍比稀釋至1∶1 280，每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù)，每孔加入100 μL不同稀釋度的血清，并設(shè)置洗滌液為空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)箱溫浴1 h后洗板4次，在酶標(biāo)板各孔加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔 IgG 100 μL，37 ℃孵育，1 h后洗板5次，各孔加入 TMB 顯色液 100 μL，室溫避光靜置 10 min后，加入終止劑終止反應(yīng)。在405 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定光密度值。按照以下公式計(jì)算P/N：P/N=檢測(cè)孔OD值/陰性孔OD值。若P/N>2.1則為陽(yáng)性，若P/N<1.5則為陰性，介于二者之間為可疑。以出現(xiàn)陽(yáng)性孔的最高稀釋度作為待檢血清效價(jià)[11-12]。

1.4.2相對(duì)免疫保護(hù)率檢測(cè)。免疫后35 d，選擇抗體效價(jià)較高的噴霧免疫組(將濃度稀釋為1×107TCID50/mL的疫苗每隔10 min進(jìn)行1次體表噴霧，連續(xù)5次)和注射免疫組(0.2 mL 1×108TCID50/mL)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，另設(shè)置未經(jīng)免疫的空白對(duì)照(CK)，每組6只棘胸蛙，分別肌肉注射0.2 mL的1×107TCID50/mL病毒液。攻毒后每天觀(guān)察并記錄感染發(fā)病與死亡情況，連續(xù)觀(guān)察21 d，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率。相對(duì)免疫保護(hù)率的計(jì)算公式[13]如下：相對(duì)免疫保護(hù)率=[1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)采用2種不同免疫方法對(duì)棘胸蛙接種疫苗后，14 d開(kāi)始產(chǎn)生較高的抗體，其血清中和抗體效價(jià)與對(duì)照組相比有顯著升高(表1)。注射免疫組在21 d達(dá)到最高的抗體效價(jià)，注射0.2 mL 1×108TCID50/mL組的血清中和抗體效價(jià)達(dá)到380.2。噴霧免疫組出現(xiàn)最高抗體效價(jià)要比注射免疫組晚，噴霧免疫組在28 d出現(xiàn)最高抗體效價(jià)，其中⑤組的抗體效價(jià)達(dá)到320.0，即噴霧組需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能發(fā)揮較好的免疫作用。對(duì)照組的血清抗體效價(jià)都小于5。

表1棘胸蛙虹彩病毒免疫血清抗體效價(jià)

Table1SerumantibodytitersofiridescentvirusinQ.spinosaafterimmunization

組別Group免疫后天數(shù)Daysafterimmunization∥d17142128①<5．012．033．9190．5190．5②<5．017．087．2380．2320．0③<5．0<5．0<5．0<5．0<5．0④<5．08．547．9112．2160．0⑤<5．017．067．6158．5320．0⑥<5．0<5．0<5．0<5．0<5．0

2.2相對(duì)免疫保護(hù)率由表2可知，對(duì)照組第10天出現(xiàn)癥狀，第11天開(kāi)始死亡，第21天總死亡率為83.3%。注射免疫組第21天總死亡率為16.7%，相對(duì)免疫保護(hù)率為80%；噴霧免疫組第21天的總死亡率為33.3%，相對(duì)免疫保護(hù)率為60%。注射免疫組效果較好，但噴霧免疫組也顯示出較好的免疫保護(hù)率。

表2 各組相對(duì)免疫保護(hù)效果

3 討論與結(jié)論

血清抗體水平的高低與動(dòng)物機(jī)體的免疫保護(hù)效果有著密切的關(guān)系。采用注射和噴霧的免疫方法，棘胸蛙都產(chǎn)生了抗體，噴霧免疫和注射免疫都可作為棘胸蛙虹彩病毒疫苗的免疫途徑。其中注射0.2 mL 1×108TCID50/mL疫苗免疫組在21 d的血清中和抗體效價(jià)達(dá)到最高(380.2)，相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)到80%；⑤組在28 d的血清中和抗體效價(jià)達(dá)到最高(320.0)，相對(duì)免疫保護(hù)率為60%。注射免疫的免疫效果要好于噴霧免疫。與注射免疫相比，噴霧免疫需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能發(fā)揮較好的免疫保護(hù)作用。

目前，疫苗免疫主要采用注射免疫，噴霧免疫主要應(yīng)用在禽類(lèi)生產(chǎn)中，通過(guò)氣霧發(fā)生器將稀釋后的疫苗形成一定大小的霧化離子，均勻地懸浮于空氣中，隨呼吸進(jìn)入家禽體內(nèi)產(chǎn)生抗體[14]。棘胸蛙屬于兩棲動(dòng)物，其可在陸地上生活，體表裸露，皮膚有豐富的微血管，采用噴霧免疫，可以利用體表皮膚及微血管吸收后進(jìn)入體內(nèi)產(chǎn)生抗體。該研究結(jié)果表明，棘胸蛙虹彩病毒疫苗采用噴霧免疫，可以產(chǎn)生有效的血清抗體效價(jià)和較高的免疫保護(hù)力，且操作簡(jiǎn)便，對(duì)棘胸蛙不造成損傷。雖然其免疫效果不如注射免疫，但若結(jié)合免疫增強(qiáng)劑、體表高效滲透劑等相關(guān)研究，噴霧免疫將成為兩棲類(lèi)動(dòng)物的一種高效、便捷的無(wú)損傷免疫途徑，為蛙病疫苗的研究與使用提供良好前景。

[1] 梅祎蕓，葉容暉，宋婷婷，等.浙江省棘胸蛙養(yǎng)殖現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56(7)：1122-1125.

[2] GRANOFF A，CAME P E，BREEZE D C.Viruses and renal carcinoma ofRanapipiens.I.The isolation and properties of virus from normal and tumor tissue[J].Virology，1966，29(1)：133-148.

[3] 王廣軍.虹彩病毒生物學(xué)研究現(xiàn)狀及展望[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(3)：74-78.

[4] ALLENDER M.Characterizing the epidemiology of ranavirus in North American chelonians：Diagnosis，surveillance，pathogenesis，and treatment[D].Illinois：University of Illinois at Urbana-Champaign，2012.

[5] CHEN Z X，ZHEN J C，JIANG Y L.A new iridovirus isolated from soft-shelled turtle[J].Virus research，1999，63(1/2)：147-151.

[6] 劉曉東，楊金先，龔暉，等.一株牛蛙源虹彩病毒的分離及鑒定[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2012，20(1)：16-21.

[7] 薛穎，白世卓，王曉龍.2株?yáng)|北林蛙源蛙病毒MCP基因序列分析[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2011，15(4)：187-189.

[8] 盛慧英，吳小平，張奇亞.單克隆抗體技術(shù)在水生動(dòng)物病毒研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)病毒學(xué)，2003，18(2)：187-190.

[9] 奕志娟.草魚(yú)出血病細(xì)胞滅活疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)[D].溫州：溫州醫(yī)科大學(xué)，2015.

[10] REED L J，MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints[J].Am J Hyg，1938，27(3)：493-497.

[11] 王琳琳，楊娜，袁悅，等.人葉酸受體自身抗體IgG酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014，46(3)：483-487.

[12] 黃立平，劉長(zhǎng)明，危艷武，等.豬圓環(huán)病毒2型血清中和抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39(9)：779-785.

[13] 曾憲輝，曾令兵，周勇，等.大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白MCP基因DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效果[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2015，22(5)：1055-1067.

[14] 邵磊，何琴.雞噴霧免疫技術(shù)要點(diǎn)[J].家禽科學(xué)，2015(7)：20-21.

科技論文寫(xiě)作規(guī)范——縮略語(yǔ)

采用國(guó)際上慣用的縮略語(yǔ)。如名詞術(shù)語(yǔ)DNA(脫氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、ATP(三磷酸腺苷)、ABA(脫落酸)、ADP(二磷酸腺苷)、CK(對(duì)照)、CV(變異系數(shù))、CMS(細(xì)胞質(zhì)雄性不育性)、IAA(吲哚乙酸)、LD(致死劑量)、NAR(凈同化率)、PMC(花粉母細(xì)胞)、LAI(葉面積指數(shù))、LSD(最小顯著差)、RGR(相對(duì)生長(zhǎng)率)，單位名縮略語(yǔ)IRRI(國(guó)際水稻研究所)、FAO(聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織)等。對(duì)于文中有些需要臨時(shí)寫(xiě)成縮寫(xiě)的詞(如表及圖中由于篇幅關(guān)系以及文中經(jīng)常出現(xiàn)的詞而寫(xiě)起來(lái)又很長(zhǎng)時(shí))，則可取各主要詞首字母寫(xiě)成縮寫(xiě)，但需在第一次出現(xiàn)處寫(xiě)出全稱(chēng)，表及圖中則用注解形式在下方注明，以便讀者理解。