微生物合成納米靈菌紅素及其對羊毛織物抗菌染色

任燕飛， 鞏繼賢， 付冉冉， 張健飛， 王富邦， 陶宇慶(.天津工業(yè)大學(xué) 紡織學(xué)院， 天津 300387； 2.天津工業(yè)大學(xué) 先進(jìn)紡織復(fù)合材料教育部重點實驗室， 天津 300387)

隨著國家對可再生資源重視程度的提高，天然染料以其良好的生物降解性、可持續(xù)性以及對人體皮膚的的無毒低刺激性而日益成為紡織品染色領(lǐng)域研究的熱點[1-2]。其中微生物染料/色素的生產(chǎn)不受季節(jié)、氣候和地域的限制，同時種類豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)周期短，將逐漸成為天然染料的主要來源[3-4]。

作為一種極具潛力的微生物染料，靈菌紅素由于具有鮮艷的顏色、良好的熱穩(wěn)定性以及某些功能性而逐漸成為研究熱點。靈菌紅素是一類微生物紅色素的統(tǒng)稱，主體結(jié)構(gòu)為三聚吡咯，其中 2-甲基-3-戊基-6甲氧基三聚吡咯是此類色素的典型代表?？僧a(chǎn)生靈菌紅素的微生物有黏質(zhì)沙雷氏菌、產(chǎn)氣弧菌以及一些放線菌[4-5]。使用靈菌紅素對蛋白質(zhì)纖維織物染色，國內(nèi)外已有一些報道，但是由于靈菌紅素為胞內(nèi)色素，需要使用有機(jī)溶劑將色素提取出來。同時，靈菌紅素幾乎不溶于水，制備染液時同樣需要使用有機(jī)溶劑溶解色素。有機(jī)溶劑的使用既提高了成本,又與天然染料綠色環(huán)保的宗旨不符[6-7]。

本文使用黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵直接制備了靈菌紅素納米分散液，表征分析了此分散體系的粒徑分布和色素濃度，以此作為染液對羊毛織物染色，系統(tǒng)地研究了染色條件對織物顏色和抗菌性能的影響。染液的制備及染色過程完全避免了有機(jī)溶劑的使用，綠色環(huán)保，且此方法具有普遍適用性，可推廣至其他非水溶性的微生物胞內(nèi)色素。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

織物：平紋羊毛織物，面密度為125 g/m2，經(jīng)密為210 根/(10 cm)，緯密為180 根/(10 cm)，購自上海市紡織工業(yè)技術(shù)監(jiān)督所。

菌種：黏質(zhì)沙雷氏菌 (ATCC 8100)、金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)和大腸桿菌 (ATCC 8739)，均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

試劑：靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)，購自英國Abcam貿(mào)易有限公司；丙三醇、吐溫-80、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉、瓊脂粉，均由北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

儀器：DelsaNano C型激光粒度分析儀，美國Beckman Coulter公司；UV-6100型紫外-可見分光光度計，上海美普達(dá)儀器有限公司；ECO紅外染色機(jī)、Datacolor SF-600型測色配色儀，美國Datacolor公司；LRH-150 型生化恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司；Scan-500型全自動菌落計數(shù)儀，法國Interscience公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1納米靈菌紅素染液的制備

將活化后的黏質(zhì)沙雷氏菌接種至種子培養(yǎng)液中，在30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)20 h。然后將黏質(zhì)沙雷氏菌種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28 ℃、200 r/min搖床中發(fā)酵培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后，使用離心機(jī)在10 000 r/min、10 ℃條件下對發(fā)酵液進(jìn)行離心，時間為10 min，去除菌體后得到納米靈菌紅素染液。

種子培養(yǎng)液：5 g/L酵母粉、10 g/L蛋白胨、3 g/L氯化鈉、2 g/L氯化鉀。

發(fā)酵培養(yǎng)液：蛋白胨 15 g/L、0.3%丙三醇、1.8%吐溫-80、2 g/L硫酸鎂、3 g/L氯化鈉、2 g/L氯化鉀。

1.2.2靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1 mg靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于10 mL 90%酸性乙醇水溶液中，pH值為3，以此作為母液進(jìn)行梯度稀釋，分別測定稀釋后溶液在535 nm波長條件下的吸光度，繪制靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)吸光度的擬合直線。

1.2.3納米靈菌紅素染液對羊毛織物染色

在紅外染色機(jī)中使用制備得到的納米靈菌紅素染液對羊毛織物染色，工藝如圖1所示。室溫入染，升溫速率為3 ℃/min，浴比為1∶40。分別探究染色溫度、時間及染浴pH值對染色效果的影響。

圖1 染色工藝曲線Fig.1 Dyeing process curve

1.3 測試方法

1.3.1粒徑測試

使用DelsaNano C型激光粒度分析儀測定納米靈菌紅素的粒徑分布及多分散指數(shù)，測試模式選擇CONTIN，測試溫度為25 ℃，每次測試重復(fù)3次。

1.3.2K/S值及顏色特征值測試

使用Datacolor SF-600型測色配色儀測定染色羊毛織物的K/S值及L*、a*、b*值。

1.3.3染色牢度測試

耐摩擦色牢度根據(jù)GB/T 3920—2008《紡織品 色牢度試驗 耐摩擦色牢度》測定；耐皂洗色牢度根據(jù)GB/T 3921—2008《紡織品 色牢度試驗 耐皂洗色牢度》測定；耐汗?jié)n色牢度根據(jù)GB/T 3922—2013《紡織品 色牢度試驗 耐汗?jié)n色牢度》測定；耐曬色牢度根據(jù)GB/T 8427—2008《紡織品 色牢度試驗 耐人造光色牢度：氙弧》測定。

1.3.4抗菌性能測試

根據(jù)GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評價 第3部分：振蕩法》對染色羊毛織物進(jìn)行抗菌性能測試，對照樣采用未經(jīng)染色的羊毛織物。實驗菌種為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。原織物和染色織物分別接觸振蕩菌液，溫度為24 ℃，時間為18 h，菌液濃度為2×104～3×104CFU/mL。接觸振蕩后用10倍稀釋法稀釋菌液并涂平板，其中大腸桿菌稀釋5次，金黃色葡萄球菌稀釋4次，通過所涂平板上的菌落數(shù)計算振蕩接觸織物后的菌液濃度。抑菌率計算公式為

式中：R為染色羊毛織物的抑菌率，%；A為未經(jīng)染色的羊毛織物振蕩接觸菌液后燒瓶內(nèi)的菌液濃度，CFU/mL；B為染色羊毛織物振蕩接觸菌液后燒瓶內(nèi)的菌液濃度，CFU/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米靈菌紅素染液的制備

圖2示出納米靈菌紅素染液的制備過程。

圖2 納米靈菌紅素染液制備過程Fig.2 Preparation of nano prodigiosins

靈菌紅素幾乎不溶于水，為胞內(nèi)色素，在常規(guī)的發(fā)酵液中大部分色素存在于菌體內(nèi)部。通過在發(fā)酵液中添加非離子表面活性劑吐溫-80，可提高細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，使在菌體內(nèi)部合成的色素向外轉(zhuǎn)移。同時，發(fā)酵液中非水溶性的靈菌紅素會被非離子表面活性劑包覆，形成色素的膠束體系，極大程度上降低了發(fā)酵液中游離靈菌紅素的濃度，這進(jìn)一步促進(jìn)了胞內(nèi)色素向外轉(zhuǎn)移，形成更多的靈菌紅素-吐溫-80膠束[8-9]。發(fā)酵結(jié)束后去除菌體，即得到納米靈菌紅素分散液，以此作為染液進(jìn)行后續(xù)的染色實驗。

2.2 納米靈菌紅素的粒徑分布

圖3示出納米靈菌紅素分散液的粒徑分布。粒徑分布在152.4～648.4 nm之間；色素的平均粒徑為285.8 nm；多分散指數(shù)為0.193，表明納米靈菌紅素的粒徑分布集中。納米級的色素分散系以及集中的粒徑分布既可保證分散液的均一穩(wěn)定，又可保證染色織物的勻染性。

圖3 納米靈菌紅素分散液粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of prodigiosins nano-dispersion

2.3 納米靈菌紅素染液色素質(zhì)量濃度

圖4示出靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合得到的線性回歸方程為

y=0.278 84x+0.009 97,R2=0.999 94

圖4 靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度擬合直線Fig.4 Fitting straight line of concentration and absorbance of prodigiosin standard

式中：x為色素質(zhì)量濃度，mg/L；y為吸光度。

使用pH值為3的90%乙醇溶液稀釋納米靈菌紅素染液，經(jīng)離心去除不溶物后，測定535 nm波長條件下的吸光度，經(jīng)過計算得到納米靈菌紅素染液中色素的質(zhì)量濃度為18.3 mg/L。

2.4 染色溫度對染色效果的影響

溫度是羊毛織物染色過程中非常重要的因素，圖5和表1示出溫度對羊毛織物染色效果的影響，染色時間設(shè)為30 min。隨著染色溫度的升高，織物色深度逐漸加深，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時，羊毛織物的K/S值最大。染色溫度為100 ℃時，色深度略有下降。同時羊毛織物的顏色變得晦暗，這可能是由于在長時間的高溫條件下，且染罐中有一定壓力，靈菌紅素分子上的亞氨基與羊毛蛋白分子中的某些氨基酸發(fā)生微弱的反應(yīng)，破壞了色素的發(fā)色團(tuán)，因此，最適染色溫度為90 ℃。

圖5 不同溫度染色羊毛織物Fig.5 Dyed wool fabrics under different temperatures

表1 不同溫度下羊毛織物的染色效果Tab.1 Dyeing effect of wool fabrics dyed under different temperatures

2.5 染色時間對色深度的影響

圖6示出染色時間對羊毛織物色深度的影響。隨著染色時間的延長，織物K/S值逐漸增加，直到纖維表面與內(nèi)部的染料濃度達(dá)到平衡。當(dāng)染色時間超過20 min后，色深度逐漸下降，這是由于靈菌紅素分散系在長時間的高溫下逐漸破壞，染浴中染料聚集的機(jī)會增多，聚集程度增大，靈菌紅素發(fā)生沉降，染色平衡被打破, 染料的解析大于吸附, 所以染色羊毛織物的K/S值開始下降。因此，最優(yōu)染色時間為20 min。

圖6 染色時間對羊毛織物色深度的影響Fig.6 Effect of dyeing time on color depth of dyed wool

2.6 染液pH值對染色效果的影響

經(jīng)測定，納米靈菌紅素分散液的pH值為8.1。由于羊毛耐酸不耐堿，對羊毛織物的染色需要在酸性或中性條件下進(jìn)行，分別調(diào)節(jié)納米靈菌紅素染液的pH值為2.1、4.1、6.1和8.1，在最適染色溫度和時間下對羊毛織物染色，結(jié)果如圖7及表2所示。可以看出，染液pH值對染色效果影響明顯，其中當(dāng)pH值為2.1時，羊毛織物的顏色最深。這是由于隨著pH值的降低，靈菌紅素在水中的溶解度會增加，染料只有在溶解狀態(tài)下才能上染羊毛纖維，溶解度的提高會增加染料的上染。靈菌紅素的等電點在9.7左右[10]，羊毛織物的等電點在4.2～4.8之間，當(dāng)染液pH值為6.1和8.1時，羊毛織物帶負(fù)電，靈菌紅素帶正電，電荷引力促進(jìn)色素向纖維轉(zhuǎn)移，羊毛織物的色深度比染液pH值為4.1時要高。

圖7 不同pH值染色羊毛織物Fig.7 Dyed wool fabrics under different pH values

表2 不同pH值的染液中羊毛織物的染色效果Tab.2 Dyeing effect of wool fabrics dyed under different pH values

當(dāng)染液pH值為2.1時，羊毛織物的b*值為負(fù)，織物表現(xiàn)出略帶藍(lán)光，這是靈菌紅素的顏色對pH值敏感所導(dǎo)致的。圖8示出靈菌紅素乙醇溶液在不同pH值下的顏色情況。靈菌紅素在酸性條件下呈紫紅色，隨著pH值的增大，色素逐漸由紫紅色變?yōu)榧t色，而后變?yōu)槌壬?，并最終呈現(xiàn)黃色[8]。結(jié)合表2中羊毛織物的染色效果可推測，染色后羊毛纖維內(nèi)部環(huán)境的pH值在8左右。當(dāng)染液pH值為2.1時，靈菌紅素以結(jié)合了大量氫離子的形式上染，顏色由淺紅色向紫紅色轉(zhuǎn)變，染色織物表現(xiàn)出略帶藍(lán)光。

圖8 pH值對靈菌紅素溶液顏色的影響Fig.8 Effect of pH value on color of prodigiosins solution

2.7 抗菌性

抗菌測試所涂平板如圖9、10所示?？擅黠@看出，不同pH條件下納米靈菌紅素染色羊毛織物對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)均有明顯的抑制作用，而對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑制作用并不顯著，這與靈菌紅素對革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌機(jī)制不同有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報道，靈菌紅素會阻礙大腸桿菌的核糖體(RNA)和蛋白質(zhì)的合成，阻止細(xì)胞分裂，破壞外膜完整性并抑制細(xì)胞呼吸，但是靈菌紅素并不能殺死或溶解大腸桿菌，只是抑制它們的分裂和代謝。相比之下，靈菌紅素可以誘導(dǎo)革蘭氏陽性菌產(chǎn)生自溶酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞溶解與死亡[11-12]，因此，靈菌紅素染色羊毛織物對金黃色葡萄球菌的抑菌率明顯高于大腸桿菌。

圖9 不同pH值染色織物金黃色葡萄球菌抗菌實驗菌落數(shù)Fig.9 Colony counts from fabrics dyed under different pH values against S. aureus. (a) Original fabric (585 CFU); (b) pH=2.1 (5 CFU); (c) pH=4.1 (8 CFU); (d) pH=6.1 (15 CFU); (e) pH=8.1 (27 CFU)

圖10 不同pH值染色織物大腸桿菌抗菌實驗菌落數(shù)Fig.10 Colony counts from fabrics dyed under different pH values against E. coli. (a) Original fabric (101 CFU); (b) pH=2.1 (64 CFU); (c) pH=4.1 (66 CFU); (d) pH=6.1 (68 CFU); (e) pH=8.1 (72 CFU)

對圖9、10抗菌實驗平板菌落計數(shù)， 計算染色羊毛織物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率，如圖11所示。當(dāng)染液pH值為2.1時，染色羊毛織物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率最高，分別為99.1%和36.6%。抑菌率的不同一方面與織物色深度即靈菌紅素的上染量有關(guān)，另一方面與染色過程染液的pH值有關(guān)。細(xì)菌帶負(fù)電荷，由于靈菌紅素的等電點在9.7左右，染液pH越小，靈菌紅素所帶正電荷越大，這促進(jìn)了靈菌紅素與細(xì)菌的吸附接觸，從而表現(xiàn)為抑菌率的提高。結(jié)合圖7、表2中織物的染色效果以及圖11中織物的抗菌性，選定最適染液pH值為2.1。

圖11 染色羊毛織物的抑菌率Fig.11 Antibacterial ratio of dyed wool fabrics

2.8 染色羊毛織物的染色牢度

在最優(yōu)工藝(溫度為90 ℃，時間為20 min，染液pH值為2.1)條件下，染色羊毛織物色牢度如表3所示。染色后羊毛織物經(jīng)過皂煮去除浮色，耐摩擦和皂洗色牢度均較高，耐汗?jié)n色牢度同樣在4級以上，可以滿足服用要求。然而日曬牢度僅為1級，這與其他文獻(xiàn)報道一致，包括靈菌紅素在內(nèi)的絕大多數(shù)微生物色素的光穩(wěn)定性差，導(dǎo)致其染色后的織物日曬牢度低。如何提高微生物染料的光穩(wěn)定性，提升染色織物的日曬牢度將成為微生物染料在紡織染色領(lǐng)域的研究重點。

表3染色羊毛織物的色牢度

Tab.3Fastnesspropertiesofdyedwoolfabrics級

3 結(jié) 論

1) 通過微生物發(fā)酵制備得到的納米靈菌紅素分散液的平均粒徑為285.8 nm，多分散指數(shù)為0.193，粒徑分布集中，色素分散液均一穩(wěn)定。納米靈菌紅素染液中靈菌紅素的質(zhì)量濃度為18.3 mg/L。

2) 納米靈菌紅素對羊毛織物染色的最優(yōu)工藝為：染色溫度90 ℃，時間20 min，染液pH值2.1。此時染色羊毛織物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率均最高，分別為99.1%和36.6%。納米靈菌紅素染色羊毛織物對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌。

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