小球藻培養(yǎng)的初步研究

耿曉玲

(江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)紡織工程系， 江蘇 江陰 214433)

小球藻為綠藻門小球藻屬單細(xì)胞綠藻,含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂類、微量元素和一些生物活性代謝產(chǎn)物[1-3],不僅廣泛應(yīng)用于保健食品、飼料、食品添加劑、精細(xì)化工品和醫(yī)藥制劑原料，在污水處理,水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料以及畜牧飼料添加劑的生產(chǎn)等方面也被廣泛應(yīng)用[4-5]。小球藻的培養(yǎng)方式主要有開放式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)。開放式培養(yǎng)由于受到自然條件如陽光、溫度等的影響和限制, 產(chǎn)量不穩(wěn)定，易受到他種生物的污染甚至取食,引起培養(yǎng)藻液的退化。封閉式培養(yǎng)相對而言便于控制、能抗污染、可提高產(chǎn)率，整個(gè)系統(tǒng)穩(wěn)定性好[6]。本文研究了封閉式培養(yǎng)條件下小球藻的生長，探討光照方式、光強(qiáng)以及培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素對小球藻生長的影響，為提高小球藻的產(chǎn)量，增加藻粉的收率提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種:小球藻Chlorella zofingensis屬于綠藻門，直徑3～10微米，由中國科學(xué)院提供。培養(yǎng)基:BG-11。培養(yǎng)基BG-11主要成分見表1。

表1 培養(yǎng)基BG-11主要成分一覽表

A5按以下物質(zhì)稱量并定容至1000mL。A5成分見表2。

表2 A5成分明細(xì)表

1.2 主要儀器

主要儀器見表3。

表3 主要儀器一覽表

2 菌種的培養(yǎng)方法

2.1 菌種的分離純化

將BG-11瓊脂培養(yǎng)基放入水浴中加熱至融化，倒平板制得平板，將整個(gè)培養(yǎng)皿皿底劃分為1，2，3，4四個(gè)面積不等的部分，待用。挑取菌種，按照無菌操作流程進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

2.2 小球藻生長的通氣培養(yǎng)裝置

通氣培養(yǎng)裝置主要由長方體水槽，光源系統(tǒng)，控溫系統(tǒng)，水循環(huán)系統(tǒng)，空氣供給系統(tǒng)和CO2供給系統(tǒng)組成。容器為平板玻璃制成的長方體水槽，水槽底部設(shè)有有機(jī)玻璃支架；光源系統(tǒng)為4根日光燈直射；控溫系統(tǒng)由恒溫水浴、輸水管和熱交換器組成，控溫范圍0～50℃，控溫精度0.1℃；水槽內(nèi)水循環(huán)系統(tǒng)是由通氣沙頭組成，保持各部分水溫一致。空氣供給系統(tǒng)由小型空氣泵、輸氣管、流量調(diào)節(jié)閥門和沙頭組成，供氣壓強(qiáng)0.04MPa，每個(gè)培養(yǎng)管的氣流大小都可單獨(dú)調(diào)節(jié)，獲得所需的氣流。pH值控制8～9的范圍內(nèi)。

2.3 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

將平板上的菌種接到2L錐形瓶中，使用無菌培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在室溫24°C的環(huán)境中進(jìn)行培育，培養(yǎng)至對數(shù)周期,接種至10L培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)周期。取藻液，4000r /min 離心8min，收集藻細(xì)胞，無菌水清洗兩次，再將離心收集的藻種分別接種于培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始OD550為0.5± 0.005，經(jīng)處理的藻液分裝入玻璃容器中，每個(gè)玻璃缸為35L，置于通氣培養(yǎng)裝置中，進(jìn)行通氣培養(yǎng)。

2.4 細(xì)胞干重的測定

將0.45μm濾膜放入烘箱中于65℃烘至恒重，編號，稱重，每組做3個(gè)平行，取平均值。已烘干至恒重的濾膜放入針頭濾器中，精確吸取5ml藻液于注射器內(nèi)，并注入到針頭過濾器中過濾，用蒸餾水沖洗2～3次，藻體連同濾膜放入65℃烘箱中烘至恒重，再稱重。

2.5 生長速率測定

采用BG-11 培養(yǎng)基，在200μmol m-2s-1，( 30 ± 1) ℃條件下通氣培養(yǎng)小球藻，接種后1～3d，藻液OD 值快速增長，第4天，增長速率明顯減緩，4d 以后，OD 值變化不明顯。所以，用培養(yǎng)前4d 的平均生長速率表示各種培養(yǎng)條件下小球藻的比生長速率μ(d-1)。

式中，OD1和OD2分別是剛接種和培養(yǎng)4d 的藻液OD 值，t1和t2是對應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間( d) ，t2-t1= 4(d)。

2.2.6 氮濃度對小球藻生長的影響

以硝酸鈉調(diào)節(jié)氮濃度，加入硝酸鈉的濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L,其他各組分保持一致，實(shí)驗(yàn)中的光源為日光燈照射，溫度控制在24℃左右,其他培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.7 Fe3+濃度對小球藻生長的影響

分別向5組玻璃缸( 每組3個(gè)平行樣) 補(bǔ)加FeCl3·6H2O 與EDTA-2Na 等物質(zhì)的量混合液，補(bǔ)加的Fe3+的濃度依次為0，0.1，0.3，0.5，0.7mol /L，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.8 不同磷濃度對小球藻生長的影響

分別向5組玻璃缸補(bǔ)加K2HPO4溶液，濃度依次為10，20，30，40，50mg /L，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.9 不同鹽度培養(yǎng)條件下小球藻的生長速率

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基NaCl濃度依次為0，0.1，0.3，0.5，0.7mol /L，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.10 光照對小球藻生長的影響

采用不同的光照方式，小球藻分3批進(jìn)行培養(yǎng)，分別為全光照，間隔光照，黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)11天，11天后對3批小球藻進(jìn)行干重測定，期間3批小球藻的培養(yǎng)基，pH值，溫度相同。將室內(nèi)培養(yǎng)的10L 瓶中的小球藻轉(zhuǎn)到室外，在全光照條件下調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，分別為1000，3000，5000，7000lux,培養(yǎng)11天，接種時(shí)密度控制在OD550為0.5± 0.005，培養(yǎng)方式為人工通氣。反應(yīng)器：“S”型反應(yīng)器，容量3500L。環(huán)境因素的測量方式為連續(xù)測量11天的光強(qiáng)，如遇到陰天，雨天正常進(jìn)行測量。生長數(shù)據(jù)的測量為每天下午2點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)水，2∶30進(jìn)行取樣測干重。

3.1 結(jié)果分析

3.1.1 不同氮濃度培養(yǎng)條件下的小球藻的生長速率

小球藻生長速率隨著培養(yǎng)基氮源濃度加大而提高，5組不同氮源濃度培養(yǎng)條件下，氮源濃度為0.1g/L時(shí)，其生長速率與其他4組差異極顯著，當(dāng)?shù)礉舛葹?.2g /L 時(shí)，生長速率與其他4組差異極顯著，氮源濃度為0.3g /L與0.4g /L 兩組間生長速率沒有顯著差異,0.4g/L小球藻的生長速率開始下降。不同氮濃度對生長速率的影響見圖1。

圖1 不同氮濃度對生長速率的影響

氮是微藻生長必需的大量元素之一，對于藻類的生長、繁殖等生理活動有著重要的作用，不同的藻種對氮源的要求有差異，氮源的種類、濃度發(fā)生變化，會影響微藻的生理生化特性，如微藻的生長狀況，類胡蘿卜素的積累，胞外多糖的產(chǎn)生，脂肪酸含量以及酶活性等。實(shí)驗(yàn)表明氮濃度對小球藻的生長速率有著顯著的影響，隨著氮濃度的增加，生長速率提高了,0.4g/L小球藻的生長速率開始下降。

3.1.2 不同鐵濃度培養(yǎng)條件下小球藻的生長速率

鐵濃度的變化沒有對小球藻的生長產(chǎn)生明顯的影響。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同濃度Fe3+( 10～160mg /L) 培養(yǎng)小球藻，生長速率沒有顯著差異。不同鐵濃度對小球藻生長速率的影響見圖2。

圖2 不同鐵濃度對小球藻生長速率的影響

鐵元素是植物生長所必需的微量元素，但在實(shí)驗(yàn)中表明Fe3+對生長速率的影響不大。

3.1.3 不同磷濃度培養(yǎng)條件下小球藻生長速率

磷濃度的變化沒有對小球藻的生長產(chǎn)生明顯的影響。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同濃度K2HPO4( 10～50mg /L) 培養(yǎng)小球藻，生長速率沒有顯著差異。不同磷濃度對小球藻生長速率的影響見圖3。

圖3 不同磷濃度對小球藻生長速率的影響

磷濃度增加至30～40mg/L 時(shí)小球藻的生長速度最快但不明顯表明。說明小球藻對磷濃度變化的適應(yīng)能力很強(qiáng)，磷濃度的變化不會影響其生長。

3.1.4 不同鹽度培養(yǎng)條件下小球藻的生長速率

NaCl 濃度不高于0.4mol /L 時(shí)，小球藻生長速率隨鹽濃度的增加而增加，NaCl 濃度0.4mol /L 之后生長速率開始下降。不同鹽度對小球藻生長速率的影響見圖4。

有關(guān)鹽度對小球藻生長、光合速率、葉綠素含量的研究已有一些報(bào)道，一般來講小球藻對鹽度有較強(qiáng)的適應(yīng)性，但鹽度過高時(shí)藻體開始出現(xiàn)發(fā)白、沉底現(xiàn)象，以后藻體陸續(xù)死亡。

本研究中，在鹽度不高于0.4mol /L 的范圍內(nèi)，鹽度增高對小球藻生長影響不顯著，當(dāng)鹽度達(dá)到0.5mol時(shí)，生長速率開始降低，鹽度為0. 4mol /L 時(shí)，小球藻的生長速率達(dá)到最高。

3.1.5 光照對小球藻生長的影響

光照方式對小球藻生長的影響見表4，表5光照強(qiáng)度對小球藻生長的影響。

表4 光照方式對小球藻生長的影響

表5 光照強(qiáng)度對小球藻生長的影響

最后獲得小球藻干重分別為0.985g，0.761g，0.243g。由此可見，小球藻在全光照條件下能夠正常的生長，間隔光照條件下小球藻的生長受到了一定的影響，在黑暗條件下小球藻生長的極其緩慢。在全光照條件下，光照強(qiáng)度也影響著小球藻的生長，在3000～5000lux之間，小球藻的生長情況良好，光照強(qiáng)度過低或過高不利于小球藻的生長。

隨著小球藻應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，其發(fā)展前景將更加廣闊。而小球藻的大量生產(chǎn)影響著小球藻的研究與發(fā)展。本文從培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分分,光強(qiáng)別加以討論分析，得出以下結(jié)論：在小球藻的培養(yǎng)過程中，氮濃度對小球藻的生長速率有著顯著的影響，隨著氮濃度的增加，生長速率提高到0.4g/L時(shí)，小球藻的生長速率達(dá)到最佳。Fe3+對小球藻的影響不大。小球藻對磷濃度變化的適應(yīng)能力很強(qiáng)，30～40mg/L 時(shí)小球藻的生長速度最快，但不明顯?？傮w來說鐵元素與磷元素在此實(shí)驗(yàn)中對小球藻的生長速率沒有顯著的影響。在鹽度不高于0.4mol /L 的范圍內(nèi)，鹽度增高對小球藻生長影響不顯著，當(dāng)鹽度達(dá)到0.5mol時(shí)，生長速率開始低，鹽度為0.4mol /L 時(shí)，小球藻的生長速率達(dá)到最高。

在光照對比實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)全光照有利于小球藻的生長，而在黑暗條件中小球藻生長緩慢。在全光照條件下,小球藻在3000～5000lux之間生長情況良好，光照強(qiáng)度過低或更高不利于小球藻的生長。

[1] 李師翁,李虎乾.小球藻干粉的營養(yǎng)學(xué)與毒理學(xué)研究[J].食品科學(xué),1997,18(7):48- 51.

[2] 黃冠華,陳 峰,任慶功.應(yīng)用小球藻制備生物柴油[J].太陽能學(xué)報(bào),2010，31(9):1085-1091.

[3] 胡月薇,邱承光.小球藻處理廢水研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2003,26(4):48-49.

[4] Chen Ying, Wang Yiqin,Sun Yongru,et al.Highly efficient expression of rabbit neutrophil peptide-1 gene in chlorella ellip so idea cells[J].Curr Genet,2001,39:365-370.

[5] 王業(yè)勤,李勤生.小球藻應(yīng)用研究動態(tài)[J].微生物學(xué)通報(bào),1985,12(6):275-277.

[6] 李師翁,李虎乾,張建軍.小球藻大規(guī)模培養(yǎng)研究的進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào),1998,15(4):14-18.

(本文文獻(xiàn)格式：耿曉玲.小球藻培養(yǎng)的初步研究[J].山東化工，2018，47(02)：35-37,39.)