向日葵黃萎病種子帶菌研究

張貴，張園園，田永偉，趙曉軍，張光，周洪友，景嵐，趙君*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古烏拉特前旗農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古烏拉特前旗014400)

向日葵是一種起源于美洲的油料作物，廣泛分布于歐洲、亞洲、美洲等地，目前已經(jīng)成為世界第4大油料作物[1]。近年來，由于國外向日葵育種材料和雜交種的大量引入，使得我國向日葵黃萎病呈現(xiàn)逐年加重的態(tài)勢。2009年向日葵病害普查結(jié)果表明，全國向日葵產(chǎn)區(qū)都有黃萎病發(fā)生，但以寧夏黃灌區(qū)發(fā)生最重，平均發(fā)病率達(dá)40%，黑龍江地區(qū)以15%的平均發(fā)病率次之，而內(nèi)蒙古地區(qū)的發(fā)病率介于10%～15%之間（采自向日葵產(chǎn)業(yè)體系數(shù)據(jù)庫）。

向日葵黃萎?。╒erticillium Wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的一種土傳病害，該病菌可以侵染多種寄主作物，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重下降[2]。由于大麗輪枝菌存在于土壤中，因此微菌核是其在土壤中存活的主要形式，它能夠通過農(nóng)事操作、土壤和水進(jìn)行傳播[3]。由于微菌核能夠在土壤中存活數(shù)年[4]，因此對向日葵黃萎病的防治非常困難。目前生產(chǎn)中主要采用種植抗黃萎病向日葵雜交種、施用含有氨和亞硝酸的肥料以及與禾本科作物輪作等措施來控制向日葵黃萎病的發(fā)生[5-8]。裴旭等[9]研究表明，多錳鋅和乙霉威等化學(xué)藥劑對向日葵黃萎病菌有很好的抑菌效果，因此，可以通過藥劑拌種處理來防控向日葵黃萎病。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)周洪友教授的課題小組也開展了一系列有關(guān)向日葵黃萎病生防菌的篩選、鑒定，以及田間防治效果的研究，這些研究結(jié)果為后續(xù)利用生防菌進(jìn)行拌種處理防控向日葵黃萎病提供了可能[10-11]。

已有的研究結(jié)果表明，常規(guī)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基或吸墨紙法可以用來分離生菜和南瓜種子上攜帶的黃萎病菌[12-14]。但是由于上述方法分離時間較長且雜菌容易抑制黃萎病菌的生長等缺點限制了其廣泛應(yīng)用。基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測種子帶菌的方法具有準(zhǔn)確、省時、特異的優(yōu)點，且分離鑒定的結(jié)果快速可靠，目前已經(jīng)被應(yīng)用到土壤和種子中進(jìn)行多種植物病原菌的快速檢測[15-20]。

利用PCR方法檢測向日葵種子中黃萎病菌的研究還未有相關(guān)報道。因此，本研究以向日葵種子的種皮DNA為模板，利用真菌的通用引物和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer,ITS）序列內(nèi)側(cè)黃萎菌特異引物進(jìn)行巢式PCR擴增，以快速檢測向日葵種子是否攜帶黃萎病菌。為了驗證上述結(jié)果，以帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）分子標(biāo)記的黃萎病菌接種向日葵的根部，通過熒光顯微鏡觀察灌漿后的向日葵種子的種皮是否帶菌。這一研究結(jié)果可為明確向日葵種皮帶菌進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播以及藥劑拌種防控向日葵黃萎病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的向日葵品種來自國家向日葵產(chǎn)業(yè)體系育種崗位。油葵品種：S26、赤029X115R、F08-2；食葵品種：三道眉、LD5009、黑大片、3638C。實驗室留存的種子也由國家向日葵產(chǎn)業(yè)體系提供。田間采集的種子來自內(nèi)蒙古呼和浩特農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田種植的向日葵食葵品種LD5009、三道眉、3638C。供試向日葵品種具體信息詳見表1。

供試接種的向日葵黃萎病菌VDGn3菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子植物病理室提供，供試接種的向日葵品種食葵LD5009為商業(yè)銷售雜交種，VDGn3帶GFP標(biāo)記的突變體來自本實驗室。大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化參照DOBINSON[21]的方法進(jìn)行；表達(dá)有GFP熒光突變體的鑒定參照本實驗室已經(jīng)發(fā)表的方法[22]進(jìn)行。

表1 供試向日葵品種名稱及來源Table 1 Names and origins of the tested sunflower varieties

1.2 向日葵種子種皮的獲得和DNA提取

用2%NaClO溶液浸泡向日葵種子5 min，然后將無菌水浸濕的濾紙放置在90 mm培養(yǎng)皿中，將去殼的向日葵種子放置在濾紙上。待向日葵種子吸水膨脹后（室溫放置3 h），取下向日葵種子的種皮，將每4粒種子的種皮放入一個已滅菌的EP管中作為1份樣本，－20℃保存用于提取DNA。

向日葵種子種皮DNA的提取參照《分子克隆》中的方法[23]。具體的操作方法如下：將收集的向日葵種子的種皮用液氮冷凍后迅速研磨成白色粉末狀，加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取液，65℃水浴30 min，每10 min振蕩1次；隨后加入等體積的氯仿-酚-異戊醇（體積比為25∶24∶1）混合液，振蕩混勻后靜置10 min，1.2萬r/min離心后取上清液；再加入等體積異丙醇，顛倒混勻，在－20℃中放置30 min，1.2萬r/min離心后棄上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2次，去除殘余液體，晾干后加入20 μL無菌水溶解。吸取2 μL DNA在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，同時取2 μL DNA在Nanodrop 2000（美國Thermo Scientific公司）上測定其濃度，其余DNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 向日葵種子種皮攜帶大麗輪枝菌的檢測

首先，利用真菌rRNA基因ITS區(qū)通用引物ITS1/ITS4（表2）對種皮DNA進(jìn)行擴增。PCR擴增體系為：10×Taq 緩沖液 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.25 μL，10 mmol/L引物ITS1、ITS4各0.5 μL，2.5 U/μL Taq酶（北京天根生物公司）0.25 μL，種皮DNA 2.0 μL，最后加ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。

將上述擴增產(chǎn)物用ddH2O稀釋5倍后，取2 μL作為模板，用大麗輪枝菌的特異性引物VD1/VD2（表2）再次進(jìn)行擴增，以ddH2O為模板作為PCR反應(yīng)的陰性對照。引物VD1/VD2的擴增體系和反應(yīng)程序與ITS1/ITS4擴增反應(yīng)相同。取5.0 μL ITS1/ITS4擴增產(chǎn)物和巢式PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測其PCR片段大小。

表2 引物名稱和序列Table 2 Names and sequences of primers

1.4 PCR產(chǎn)物的測序和序列分析

將不同向日葵品種種皮的巢式PCR擴增產(chǎn)物與TA載體pCR2.1（美國Invitrogen公司）在14℃下連接過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1（北京全式金公司）后涂板，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。從平板上挑取白斑至無菌水中，取菌液用引物M13F/M13R（表2）進(jìn)行菌液PCR鑒定。從每個品種的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中挑取3個陽性克隆送往北京厚生博泰公司測序，將測序得到的序列用DNAMAN 5.0去除載體序列，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST序列比對工具進(jìn)行DNA序列比對，確定序列來源物種。

1.5 利用GFP標(biāo)記的大麗輪枝菌接種向日葵

帶GFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化子的菌株VDGn3經(jīng)PDA平板活化5～7 d后，從菌落邊緣挑取菌塊接入麥麩培養(yǎng)基上，用于快速擴繁大量的分生孢子。25℃培養(yǎng)7～14 d后，用清水沖洗麥麩培養(yǎng)基，用4層紗布過濾獲得分生孢子液。用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，將分生孢子液的濃度調(diào)至1×107mL－1后備用。采用紙缽撕底蘸根法進(jìn)行接種實驗[26]，具體操作如下：將向日葵品種LD5009的種子播種到裝有滅菌土的營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng)缽播種3粒種子；待向日葵幼苗長出2～4片真葉時，每缽接種分生孢子液50 mL。接種后的幼苗置于22～23℃溫室條件下等待開花灌漿后收獲種子；剝?nèi)シN子的種殼，取種皮置于有水滴的載玻片上，在BX51熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察是否有綠色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵種子種皮上攜帶黃萎病菌的檢測

以真菌通用引物對ITS1/ITS4（rRNA基因）進(jìn)行PCR擴增的結(jié)果如圖1和表3所示。供試樣本在541 bp附近出現(xiàn)2種帶形，即單一帶型和雙帶型。在油葵品種S26擴增的4份樣本中，除1份樣本沒有擴增出目的條帶外，其余3份樣本均為單一帶型；在雜交種赤029X115R的6份樣本中，3份樣本是單一帶型，3份樣本呈現(xiàn)雙帶型；在F08-2的10份樣本中，只有5份擴增出相應(yīng)的條帶，其中3份樣本為單一帶型，2份呈現(xiàn)出雙帶型。在供試的食葵品種中，LD5009的10份樣本中有4份樣本擴增出條帶，但是3份樣本為雙帶型；在黑大片的7份樣本中，4份樣本出現(xiàn)條帶，2份出現(xiàn)雙帶型；在三道眉的7份樣本中有6份樣本擴增出單一帶型，1份樣本沒有擴增出目的條帶。

為了進(jìn)一步確定擴增出的條帶是否為向日葵黃萎病菌，以ITS1/ITS4引物擴增出的PCR產(chǎn)物為模板，利用向日葵黃萎病菌的特異引物VD1/VD2（擴增rRNA基因）進(jìn)行巢氏PCR擴增，結(jié)果如圖2和表3所示。和ITS引物擴增的結(jié)果不同，利用VD1/VD2引物擴增出的條帶都是單一帶型，條帶大小為324 bp。其中：S26的4份樣本的擴增結(jié)果和ITS相似，只有3份擴增出了目的條帶；F08-2有7份樣本均擴增出單一目的條帶，比ITS擴增出的5份陽性樣本多出2份；赤029X115R有6份樣本均擴增出單一條帶。在供試的食葵品種中，ITS擴增呈現(xiàn)陽性的4份LD5009樣本都相應(yīng)地擴增出條帶；黑大片7份樣本的擴增結(jié)果和ITS相似，也只有4份樣本出現(xiàn)目的條帶；三道眉的7份樣本均擴增出單一帶型，而相對應(yīng)的ITS擴增結(jié)果中卻有1份樣本沒有擴增出目的條帶。

將上述巢氏PCR擴增得到的產(chǎn)物（單一條帶）進(jìn)行TA克隆后，用菌液PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，所得PCR產(chǎn)物大小為524 bp（圖3）。測序后在GenBank中進(jìn)行比對，結(jié)果表明，巢氏PCR擴增得到的所有單一片段的序列（登錄號:KY745897）與GenBank中已有的大麗輪枝菌ITS區(qū)序列的相似度均為100%。

2.2 不同向日葵品種攜帶黃萎病菌頻率的檢測

圖1 不同品種向日葵種皮DNA ITS1/ITS4引物的PCR擴增Fig.1 PCR products of seed coats from different sunflower varieties using ITS1/ITS4 primer pair

圖2 不同向日葵品種種皮巢式PCR產(chǎn)物Fig.2 Nested PCR products of seed coats from different sunflower varieties

表3 不同向日葵品種雙重PCR擴增帶型統(tǒng)計Table 3 Statistics of band types by nested PCR amplification in different sunflower varieties

圖3 巢式PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后陽性克隆鑒定Fig.3 Identification of positive clones of nested PCR products after transformation

為了進(jìn)一步確定不同向日葵品種攜帶黃萎病菌的頻率，我們不僅對上述品種的帶菌率進(jìn)行了重復(fù)檢測，而且還增加了3份當(dāng)年在大田中采集的已經(jīng)灌漿的不同品種的向日葵種子。PCR擴增結(jié)果（表4）顯示，在進(jìn)行檢測的58份不同品種的向日葵樣本中，39份為陽性樣本，帶菌率為22.4%。其中：田間采集的新種子3638C帶菌率最低，僅為10.0%；而實驗室留存的赤029X115R帶菌率最高，為25.0%；其余供試的向日葵品種種子帶菌率介于二者之間。同時，新采集的種子和實驗室留存的向日葵種子的黃萎病菌帶菌率沒有明顯差別。

表4 不同向日葵品種種皮帶菌率的巢氏PCR檢測結(jié)果Table 4 Contamination rate of different sunflower cultivars detected by nested PCR

2.3 利用GFP熒光標(biāo)記確定向日葵種子種皮帶菌

圖4 向日葵種子的種皮熒光觀察結(jié)果Fig.4 Observation result of the fluorescence in sunflower seed coats

為了進(jìn)一步驗證巢氏PCR技術(shù)檢測向日葵種皮帶菌的準(zhǔn)確性，將食葵LD5009向日葵幼苗接種標(biāo)記有GFP的向日葵黃萎病菌VDGn3，75 d后收獲向日葵種子。取接種株的向日葵種子種皮進(jìn)行制片后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4所示。在接種后的向日葵種子的種皮上能觀察到綠色熒光蛋白（GFP）信號，而對照向日葵植株的種子的種皮上未見有綠色熒光信號。這一觀察結(jié)果表明種皮是向日葵黃萎病菌重要的定殖部位，同時證明了上述基于巢式PCR技術(shù)檢測向日葵種皮是否攜帶黃萎病菌的準(zhǔn)確性。

3 討論

本文利用巢式PCR技術(shù)對向日葵種子的種皮是否攜帶黃萎菌進(jìn)行了檢測。這種檢測方法包括收集種子仁膜、DNA提取和用特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴增，通過快速檢測有助于及早控制向日葵黃萎病的發(fā)生?；赑CR技術(shù)檢測種子是否攜帶大麗輪枝菌的方法已經(jīng)在馬鈴薯[27-28]和橄欖樹[29]中有所報道，如DURESSA等[17]使用實時熒光定量PCR方法檢測了菠菜種子中是否含有大麗輪枝菌；SOUSA等[30]采用實時熒光定量PCR方法檢測了菜豆種子中是否攜帶有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。以上均說明利用PCR方法能夠便捷地檢測種子是否帶菌。盡管SACKSTON等[31]報道了可以從向日葵種子的種殼和種皮上分離到大麗輪枝菌，但是本實驗室嘗試了多次后，發(fā)現(xiàn)種皮上攜帶多種病原菌和雜菌，生長較慢的黃萎病菌往往容易被生長快的其他病菌或雜菌所抑制，因此沒有從種子上成功分離到黃萎病菌。而本文利用巢氏PCR來檢測向日葵種皮是否帶有黃萎病菌的方法，將作為后續(xù)的一種可行、便捷的方法來檢測向日葵種子是否攜帶黃萎病菌，可以在未來種子帶菌檢測中進(jìn)行推廣使用。

此外，用PCR檢測種子中是否帶有病原菌需要提取種子的DNA。由于向日葵種子的種殼具有厚且堅硬的特性，因此，利用普通DNA提取方法提取包括種殼在內(nèi)的DNA沒有可操作性，需要采用一些特殊的方法來獲取用于種子帶菌PCR檢測所需的DNA模板[32]。因此，我們將向日葵種殼經(jīng)人工剝掉后只取與種子胚緊密接觸的種皮作為提取DNA的材料，從而方便了DNA的提取。由于單粒向日葵種子的種皮量非常少，因此，我們混合了4份種子的種皮樣本進(jìn)行DNA提取。

在本實驗過程中，我們曾經(jīng)嘗試提取種皮DNA后直接用大麗輪枝菌的特異性引物進(jìn)行擴增，但多次實驗均未得到PCR條帶。究其原因可能是挑選的種子的種皮上沒有病菌，或者是種皮上攜帶的黃萎菌量很少，其DNA相對于種子的種皮DNA濃度太低。而用巢式PCR可以將種皮DNA中黃萎病菌DNA信息進(jìn)行放大，從而獲得目的條帶進(jìn)行測序分析。此外，利用真菌的通用引物對ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴增時出現(xiàn)了雙帶型，說明在向日葵種子種皮上可能存在包括黃萎病菌在內(nèi)的不同類型的其他真菌。而利用黃萎病菌的特異引物VD1/VD2進(jìn)行巢氏PCR再次擴增出單一的條帶，體現(xiàn)了黃萎病菌引物VD1/VD2的特異性。后續(xù)PCR條帶的測序結(jié)果也證實了這一推測。

在利用GFP標(biāo)記的黃萎病菌侵染向日葵根部的實驗中，我們觀察到向日葵黃萎病菌能夠到達(dá)花盤進(jìn)行侵染（文章待發(fā)表）。而在熒光顯微鏡下，我們觀察到在花盤中向日葵種皮上有非常強的GFP熒光信號，而種殼上有微弱的熒光信號，籽仁上沒有熒光信號，預(yù)示著種皮是黃萎病菌重要的定殖部位，而不是種殼和籽仁。這一結(jié)果和利用PCR檢測的結(jié)果相一致。

利用PCR方法結(jié)合熒光顯微鏡觀察驗證了向日葵種皮是攜帶黃萎病菌的重要載體。而種皮帶菌也為向日葵黃萎病菌的遠(yuǎn)距離傳播創(chuàng)造了條件。因此，在后續(xù)向日葵黃萎病的防控技術(shù)中，我們認(rèn)為在播前對向日葵種子進(jìn)行藥劑處理應(yīng)該作為一項防治向日葵黃萎病菌的必要措施。至于選用哪種藥劑進(jìn)行處理以及藥劑處理的方法還需要進(jìn)行一系列的室內(nèi)和田間試驗研究。這些結(jié)果對今后向日葵黃萎病有效防控技術(shù)研究具有非常重要的意義。

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