王漿主蛋白作為胎牛血清替代物培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1的效果及作用機(jī)制

錢浩誠(chéng)，蔣晨旻，陳華才，沈立榮*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品科學(xué)研究院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；2.中國(guó)計(jì)量大學(xué)光學(xué)與電子科技學(xué)院，杭州310018）

蜂王漿是由工蜂頭部舌腺和顎腺分泌[1]，專供給蜂王和3 d內(nèi)工蜂幼蟲食用的漿狀物質(zhì)[2]。僅僅因?yàn)閿z入的食物不同，出生時(shí)基因組相同的蜂王和工蜂的命運(yùn)完全不同，蜂王的體型、壽命遠(yuǎn)超工蜂，工蜂的系統(tǒng)也隨之退化[3]。由于蜂王漿對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的神奇作用，人們對(duì)它的研究日益深入，期望蜂王漿的功效能夠在人體再現(xiàn)。蜂王漿的成分包括水（50%～60%）、蛋白質(zhì)（18%）、糖類（15%）、脂類（3%～6%）、礦物鹽（1.5%）和維生素，蛋白質(zhì)約占蜂王漿干物質(zhì)的50%[4]，其中水溶性部分——王漿主蛋白（major royal jelly proteins,MRJPs）與蜂王漿的生物活性密切相關(guān)，是決定蜜蜂雌性幼蟲發(fā)育成為蜂王或工蜂的關(guān)鍵活性物質(zhì)[3]。

以往的報(bào)道和我們的研究表明，MRJPs對(duì)多種動(dòng)物和人體細(xì)胞有促增殖作用，具有部分替代胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）培養(yǎng)細(xì)胞的潛力[5-8]。KAMAKURA等[5]用分子質(zhì)量為57 kDa的MRJP1蛋白培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的作用，其促細(xì)胞分裂能力與蛋白濃度呈正相關(guān)；SALAZAR-OLIVO等[6]發(fā)現(xiàn)，王漿粗蛋白能促進(jìn)昆蟲細(xì)胞Tn-5B1-4增殖，且其促增殖效果強(qiáng)于FBS；WATANABE 等[7]發(fā) 現(xiàn) ，添 加 1.0 mg/mL 的MRJP1無(wú)血清培養(yǎng)基能顯著促進(jìn)人骨髓細(xì)胞U-937生長(zhǎng)；本課題組的研究證實(shí)，MRJPs能夠部分代替FBS培養(yǎng)293T、HFL-Ⅰ、HCT116及張氏肝細(xì)胞等人體細(xì)胞[8]，且MRJPs對(duì)張氏肝細(xì)胞增殖作用可能與促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成相關(guān)[9]。我國(guó)蜂王漿產(chǎn)量及出口量占全球的90%[10]，用MRJPs部分替代FBS培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)降低細(xì)胞培養(yǎng)成本，促進(jìn)蜂王漿深加工具有重要意義。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell,CHO）是在抗體生產(chǎn)、生物制藥及病毒疫苗領(lǐng)域廣泛使用的生物反應(yīng)器之一[11]。CHO細(xì)胞是一種永生細(xì)胞系，由美國(guó)科羅拉多大學(xué)學(xué)者PUCK從一成年雌性中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中分離建株，后來(lái)陸續(xù)有研究人員篩選出多種不同表型的CHO細(xì)胞株，如DUKX-B11、DG-44和CHO-K1等[11]。CHO細(xì)胞作為生物反應(yīng)器具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)，例如：培養(yǎng)及基因修飾難度低；重組基因擴(kuò)增及表達(dá)效率高；內(nèi)源蛋白分泌較少，利于外源蛋白產(chǎn)物的純化與分離；細(xì)胞具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，所表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能等方面接近于天然蛋白分子；細(xì)胞既可貼壁生長(zhǎng)，也可懸浮培養(yǎng)，其耐受剪切力和滲透壓能力良好[12-13]。目前，7成以上動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)藥物產(chǎn)品通過(guò)CHO細(xì)胞生產(chǎn)[14]。然而，與大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，CHO細(xì)胞還存在生長(zhǎng)較慢、培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、產(chǎn)量較低等缺陷，其細(xì)胞培養(yǎng)所需的FBS價(jià)格昂貴。因此，研究開發(fā)符合工業(yè)化生產(chǎn)要求、應(yīng)用成本低、高密度的CHO細(xì)胞培養(yǎng)新技術(shù)很有必要[15]。為此，我們?cè)谝延醒芯炕A(chǔ)上，進(jìn)一步開展了用MRJPs部分替代FBS培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞的系統(tǒng)性研究，旨在降低細(xì)胞培養(yǎng)成本，為蜂王漿深加工提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜂王漿

鮮蜂王漿由杭州碧于天保健品公司提供，于－80℃下保存。

1.1.2 細(xì)胞株

CHO-K1細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)條件為含10%FBS的F12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。

1.1.3 試劑

胎牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；F12K細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶，購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index,PI）染液（無(wú)RNA酶），購(gòu)自Sigma公司；四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA），購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）和常規(guī)化學(xué)試劑（均為分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

IL-161/169型氣套式CO2培養(yǎng)箱[施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DSZ5000X型倒置顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BS124S型分析電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀（日本HORIBA公司）；Countstar IC1000細(xì)胞成像儀（上海睿鈺生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MRJPs的制備及濃度測(cè)定

取50 g鮮蜂王漿溶于350 mL、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）中，4℃下攪拌24 h，1.2萬(wàn)r/min離心30 min，取上清液于透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500～14 000）中，于4℃下在雙蒸水（double distilled H2O,ddH2O）中透析24 h后得到MRJPs溶液，保存于－20℃?zhèn)溆肹6]。使用Bradford法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定MRJPs濃度[16]，用F12K培養(yǎng)基將MRJPs溶液稀釋至5 mg/mL母液備用。

1.2.2 不同MRJPs/FBS(M/F)比例培養(yǎng)基對(duì)CHOK1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHO-K1細(xì)胞，以2×103mL－1的密度接種到96孔板中，用5 mg/mL的MRJPs（M）母液或5 mg/mL的BSA（B）母液代替部分FBS（F），其代替的體積比例分別為：M/F 0/100（CK）、M/F 25/75、M/F 50/50、M/F 75/25、B/F 50/50。連續(xù)培養(yǎng)2 d后用倒置顯微鏡對(duì)CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行拍照，根據(jù)細(xì)胞形狀、大小、密度和折光率等指標(biāo)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 不同M/F比例培養(yǎng)基對(duì)CHO-K1細(xì)胞增殖速率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO-K1細(xì)胞，以2×103mL－1的密度接種到96孔板中，各組培養(yǎng)基中混合血清比例同1.2.2節(jié)，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)用MTT法于490 nm檢測(cè)各孔吸光度。

1.2.4 不同M/F比例培養(yǎng)基對(duì)CHO-K1細(xì)胞狀態(tài)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHO-K1細(xì)胞，以2×104mL－1的密度接種于6孔板中，各組培養(yǎng)基中混合血清比例同1.2.2節(jié)，連續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約90%時(shí)，消化并收集細(xì)胞，用PBS溶液將細(xì)胞稀釋至合適濃度，將細(xì)胞懸液置于專用容器中，用細(xì)胞成像儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 MRJPs部分代替FBS對(duì)CHO-K1細(xì)胞周期的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHO-K1細(xì)胞接種至25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分別采用CK、M/F 50/50和B/F 50/50培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)，用胰酶消化并收集CHO-K1細(xì)胞于離心管中，控制每管細(xì)胞數(shù)量約1×106個(gè)。用PBS溶液輕柔地清洗細(xì)胞2次，離心去除上清液后，加入100 μL PBS溶液并吹打均勻，制成細(xì)胞重懸液。用1 mL注射器將細(xì)胞重懸液慢慢注入1 mL、經(jīng)－20℃預(yù)冷的75%乙醇中，在4℃下放置過(guò)夜，固定細(xì)胞。然后于1 200 r/min下離心8 min得細(xì)胞沉淀，用500 μL PI染液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，輕輕吹打均勻后避光放置15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）計(jì)算公式如下：PI=(S期細(xì)胞+G2期細(xì)胞)/(G1期細(xì)胞+S期細(xì)胞+G2期細(xì)胞)。

1.2.6 拉曼光譜法探究MRJPs部分代替FBS對(duì)CHO-K1細(xì)胞的影響

取CK、M/F 50/50和B/F 50/50培養(yǎng)基中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHO-K1細(xì)胞，以2×103mL－1的密度接種到96孔板中連續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)到90%左右時(shí)吸出培養(yǎng)液，加入PBS溶液輕柔吹打清洗數(shù)次后吸除溶液，然后于拉曼光譜儀下進(jìn)行掃描。拉曼掃描條件如下：激光功率50 mW，激光波長(zhǎng)785 nm，物鏡倍數(shù)10×，光柵600條/mm，照射時(shí)間3 s。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有樣品至少3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)用SPSS 14.0和Excel 2016軟件進(jìn)行處理。各組間差異采用單因素方差分析（one-way analysis of variance,one-way ANOVA）。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示數(shù)據(jù)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同M/F比例培養(yǎng)基對(duì)CHO-K1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

細(xì)胞形態(tài)受各種內(nèi)外因素影響，表現(xiàn)為細(xì)胞大小、形狀、核仁、邊界變化等。用不同M/F比例的培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞2 d后在倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果（圖1）顯示：CK培養(yǎng)基（圖1A）、M/F 25/75培養(yǎng)基（圖1B）、M/F 50/50培養(yǎng)基（圖1C）、B/F 50/50培養(yǎng)基（圖1E）中的細(xì)胞形態(tài)相似，呈短梭狀或不規(guī)則鋪路卵石狀，細(xì)胞邊界清晰，屬于典型的正常CHO-K1細(xì)胞形態(tài)；而M/F 75/25培養(yǎng)基（圖1D）中的細(xì)胞形態(tài)則發(fā)生了明顯的變化，具體表現(xiàn)為細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞邊界模糊不清，細(xì)胞密度下降。用M/F 50/50培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞密度明顯大于其他培養(yǎng)基組。以上結(jié)果說(shuō)明，適宜的M/F比例能在不影響CHO-K1細(xì)胞正常生長(zhǎng)狀態(tài)的情況下提高細(xì)胞密度，顯示出促細(xì)胞增殖作用。

圖1 不同M/F比例對(duì)CHO-K1細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of different M/F ratios on CHO-K1 morphology

2.2 不同M/F比例培養(yǎng)基對(duì)CHO-K1細(xì)胞增殖的影響

由于MTT吸光度與活細(xì)胞數(shù)目在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，因此可根據(jù)吸光度大小得出相對(duì)活細(xì)胞數(shù)。圖2為CHO-K1細(xì)胞在不同M/F比例培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)的相對(duì)活細(xì)胞數(shù)。從接種48 h開始，相比于CK培養(yǎng)基，在M/F 25/75及M/F 50/50培養(yǎng)基中的相對(duì)活細(xì)胞數(shù)分別增加了23.8%和25.1%，兩者的活細(xì)胞數(shù)顯著高于CK；在接種72 h時(shí)，兩者的相對(duì)活細(xì)胞數(shù)比CK分別增加了9.9%和13.6%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，M/F 75/25培養(yǎng)基中的相對(duì)活細(xì)胞數(shù)均顯著低于CK，說(shuō)明MRJPs替代FBS的比例不可過(guò)高。而B/F 50/50培養(yǎng)基的相對(duì)活細(xì)胞數(shù)顯著低于CK及M/F 50/50培養(yǎng)基，顯示MRJPs對(duì)該細(xì)胞的促增殖能力優(yōu)于BSA。以上結(jié)果表明，M/F 25/75和M/F 50/50這2種比例的培養(yǎng)基能夠顯著促進(jìn)CHO-K1細(xì)胞增殖，其促增殖能力優(yōu)于CK培養(yǎng)基及添加BSA的培養(yǎng)基?？紤]到添加MRJPs量高更有利于降低成本，因此采用MRJPs代替50%的FBS作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.3 不同M/F比例培養(yǎng)基對(duì)CHO-K1細(xì)胞狀態(tài)的影響

將經(jīng)消化后懸浮于PBS溶液中的CHO-K1細(xì)胞置于細(xì)胞成像儀中的狀態(tài)作進(jìn)一步分析。結(jié)果（表1）顯示：與CK組相比，M/F 50/50培養(yǎng)基的細(xì)胞密度上升了23.7%，上升幅度與48 h時(shí)MTT測(cè)定結(jié)果相符；M/F 50/50培養(yǎng)基中的細(xì)胞直徑顯著高于CK組，其余各處理間細(xì)胞不存在顯著差異；此外，各處理組間細(xì)胞圓度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 MRJPs部分代替FBS對(duì)CHO-K1細(xì)胞周期的影響

基于上述結(jié)果，我們采用流式細(xì)胞儀測(cè)定了M/F 0/100（CK）、M/F 50/50和B/F 50/50培養(yǎng)基對(duì)CHOK1細(xì)胞周期的影響，以分析MRJPs對(duì)該細(xì)胞的作用機(jī)制。結(jié)果（圖3）顯示，M/F 50/50培養(yǎng)基中的細(xì)胞增殖指數(shù)分別高于CK及B/F 50/50培養(yǎng)基19.4%和29.5%。S期和G2期正是細(xì)胞大量合成DNA及蛋白質(zhì)的時(shí)期，與CK培養(yǎng)基相比，用MRJPs替代50%的FBS培養(yǎng)細(xì)胞使得處于S期與G2期的細(xì)胞總數(shù)比例上升，推測(cè)MRJPs可促進(jìn)細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)及酶的合成，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖2 不同M/F比例對(duì)CHO-K1細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of different M/F ratios on proliferation of CHO-K1 cells

表1 不同M/F比例培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響Table 1 Effect of different M/F ratios on CHO-K1 cell state

圖3 MRJPs部分代替FBS對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of MRJPs as an alternative to FBS on CHO-K1 cell cycle

2.5 拉曼光譜法測(cè)定部分代替FBS對(duì)CHO-K1細(xì)胞的影響

拉曼光譜法是一種檢測(cè)細(xì)胞及組織的快速無(wú)損方法[17-18]，該方法通過(guò)不同頻率的激光散射分析目標(biāo)物的分子振動(dòng)，以解析體系產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與含量[18]。表2為分別測(cè)定CK、M/F 50/50和B/F 50/50培養(yǎng)基中CHO-K1細(xì)胞的拉曼光譜結(jié)果[19]。平均光譜圖以1 002 cm－1處的苯基丙氨酸對(duì)應(yīng)峰為基準(zhǔn)作歸一化處理。結(jié)果顯示，大部分峰歸屬于蛋白質(zhì)及氨基酸基團(tuán)的振動(dòng)、拉伸或變形等[19-20]。由圖4可見，各組細(xì)胞拉曼光譜圖中的峰強(qiáng)度幾乎相同，峰位置也沒有發(fā)生明顯位移。以上結(jié)果說(shuō)明，用MRJPs部分代替FBS在促進(jìn)CHO-K1細(xì)胞增殖的同時(shí)，沒有大幅度改變細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及含量，也沒有誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生突變，保證了細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)，利于MRJPs在工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用。

3 討論

在細(xì)胞或組織培養(yǎng)過(guò)程中，除無(wú)血清培養(yǎng)基外，通常需要加入能促進(jìn)細(xì)胞貼壁、體外生長(zhǎng)和增殖的動(dòng)物源性血清，其中FBS是最常用的添加物。由于FBS含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)因子及促增殖因子，已成為細(xì)胞完全培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充配方[21]。但FBS的生產(chǎn)使用涉及動(dòng)物福利、技術(shù)及質(zhì)量控制等諸多問題，不同批次的FBS會(huì)存在質(zhì)量差異，在生產(chǎn)過(guò)程中還可能受到支原體和朊病毒污染[21-24]，因此生產(chǎn)成本越來(lái)越高。由于我國(guó)FBS長(zhǎng)期依賴進(jìn)口，開發(fā)生產(chǎn)適合培養(yǎng)CHO細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基深受關(guān)注。但目前無(wú)血清培養(yǎng)基還難以達(dá)到有血清的完全培養(yǎng)基的效果。為了提高無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，在實(shí)際應(yīng)用中往往需要添加生長(zhǎng)因子、激素、促貼壁物質(zhì)、酶抑制劑、結(jié)合蛋白及微量元素等多種補(bǔ)充物[25-26]。此外，目前無(wú)血清培養(yǎng)基往往價(jià)格昂貴，配方保密，使用者無(wú)法通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基組成及組分濃度來(lái)控制培養(yǎng)過(guò)程，優(yōu)化培養(yǎng)條件。由于這些問題的存在，尋找能替代FBS培養(yǎng)CHO細(xì)胞的新的補(bǔ)充物很有必要。

表2 拉曼光譜峰歸屬[19]Table 2 Raman spectrum contributions[19]

圖4 CHO-K1細(xì)胞拉曼光譜圖Fig.4 Raman spectra of CHO-K1 cells

我們之前的研究和相關(guān)報(bào)道已證明，MRJPs對(duì)大鼠肝細(xì)胞、昆蟲Tn-5B-4細(xì)胞、魚EPC細(xì)胞、Hepli4細(xì)胞[27-29]、張氏肝細(xì)胞[9]、293T細(xì)胞、HCT116及HFL-Ⅰ等多種細(xì)胞[8]具有促增殖作用。KAMAKURA等[5,27]研究發(fā)現(xiàn)，MRJPs能夠促進(jìn)肝細(xì)胞DNA及白細(xì)胞蛋白的合成，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。本研究結(jié)果表明，雖然各組細(xì)胞圓度之間沒有顯著性差異，但M/F 50/50培養(yǎng)基中的細(xì)胞直徑顯著大于CK，這可能與MRJPs促進(jìn)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的分泌有關(guān)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞形態(tài)在一定程度上反映了細(xì)胞生長(zhǎng)情況[30]，通常情況下，折光率越高、形狀越圓、體積越大的懸浮狀態(tài)細(xì)胞會(huì)越有活力。李俊俊等[31]發(fā)現(xiàn)，直徑＞13 μm的大鼠牙胚細(xì)胞增殖活性高于直徑＜13 μm的細(xì)胞；據(jù)WANG等[32]報(bào)道，伴隨著大鼠前脂肪細(xì)胞直徑的增大，G2與S期細(xì)胞比例相應(yīng)增多，脂質(zhì)含量相應(yīng)增加。已有研究證明，培養(yǎng)基中的血清濃度可極大地影響細(xì)胞的增殖能力[33]及細(xì)胞倍增時(shí)間[34]，降低血清濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)困難[35]。在培養(yǎng)基中用其他物質(zhì)代替FBS會(huì)導(dǎo)致FBS濃度降低，而MRJPs因具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，恰好能夠彌補(bǔ)低濃度FBS所造成的影響，具有成為FBS理想替代品的潛力。

拉曼光譜法由于對(duì)樣品要求較低、損傷小、檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)，在分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域受到極大關(guān)注，常被用于細(xì)胞鑒定、藥物分析、細(xì)胞篩選、腫瘤及病變細(xì)胞鑒別等[36-37]。腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞均有不同程度的差異，這種差異被稱為細(xì)胞異型性。腫瘤細(xì)胞的異型性主要表現(xiàn)在細(xì)胞核變異、體積增大、DNA含量增多，且隨著癌基因及抑癌基因突變的發(fā)生，細(xì)胞中—C＝C—、—CH2與雙鏈上不飽和基團(tuán)或電負(fù)性基團(tuán)的數(shù)量會(huì)隨之增多[38]。此外，細(xì)胞癌變經(jīng)常伴隨著染色體缺失、錯(cuò)位和細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、糖類等關(guān)鍵物質(zhì)發(fā)生改變，而拉曼光譜能夠從分子層面檢測(cè)到這些細(xì)微變化。楊文沛等[39]對(duì)肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞的拉曼光譜比較發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞的譜線強(qiáng)度整體偏弱，其核酸、蛋白質(zhì)與脂類等重要分子在結(jié)構(gòu)和含量上都發(fā)生了不同程度的改變。韋芳等[40]曾嘗試?yán)美庾V區(qū)分胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞，他們根據(jù)不同種類的胰島細(xì)胞所含激素各不相同這一理論基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜既有共同的特征峰，也有差異明顯的波峰，因而成功利用拉曼光譜法區(qū)分了這2種細(xì)胞。

以往大量研究報(bào)道已證明，拉曼光譜法能夠從分子層面上發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量及結(jié)構(gòu)的變化，不失為一種探索CHO細(xì)胞在MRJPs影響下是否發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化的新檢測(cè)方法。我們通過(guò)用拉曼光譜法研究M/F復(fù)合培養(yǎng)基對(duì)CHO-K1的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理組譜圖間峰強(qiáng)度及峰位移幾乎沒有發(fā)生變化，證明MRJPs在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，還維持了細(xì)胞內(nèi)主要物質(zhì)的含量及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為今后將該方法應(yīng)用于正常細(xì)胞評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

此外，特別需要指出的是，MRJPs的促增殖作用具有一定的選擇性。我們發(fā)現(xiàn)，HFL-Ⅰ細(xì)胞在MRJPs完全代替FBS的培養(yǎng)基（M/F 100/0）中不能正常貼壁，因此取消了M/F 100/0這一實(shí)驗(yàn)組。我們之前的研究也已經(jīng)證實(shí)，用MRJPs完全代替FBS無(wú)法保證張氏肝細(xì)胞的正常存活[9]，MRJPs對(duì)231細(xì)胞不具有促增殖作用[8]；而MUSA等[41]發(fā)現(xiàn)，采用MRJPs完全代替FBS培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞后，細(xì)胞的倍增時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常培養(yǎng)基組細(xì)胞，說(shuō)明FBS中的一些特殊生長(zhǎng)因子是MRJPs所不具備的。因此，在今后研究中需要進(jìn)一步明確MRJPs具有促增殖作用的組分，為MRJPs作為FBS代替物的研究提供更加充分的依據(jù)。

4 結(jié)論

在培養(yǎng)基中用MRJPs部分代替FBS具有促進(jìn)CHO-K1細(xì)胞增殖的作用，其最適M/F比例為50/50，用該比例培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞直徑顯著大于FBS。MRJPs與FBS配合使用能夠增大細(xì)胞增殖指數(shù)，由此推測(cè)，MRJPs對(duì)該細(xì)胞的促增殖作用可能與其促進(jìn)細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)及酶合成有關(guān)。拉曼光譜分析顯示，MRJPs既未大幅度改變細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及含量，也未誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生突變，證明MRJPs具有部分代替FBS應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)化前景。由于我國(guó)為蜂王漿生產(chǎn)和出口大國(guó)，本研究為蜂王漿深加工提供了一個(gè)新的途徑。

致謝 浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測(cè)試中心李金輝老師協(xié)助用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，謹(jǐn)致謝意！

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