晚發(fā)型重度難治性哮喘氣道炎癥表型與激素療效的臨床研究

劉振千 王凡 陳韋 韓志海

重度難治性哮喘(簡稱重度哮喘)是哮喘的一種特殊亞型，盡管給予高劑量激素吸入甚至全身激素及長效β受體激動(dòng)劑治療，仍難以控制，它雖只占不到全部哮喘的10%，但卻有較高的門急診就醫(yī)及住院率，消耗了大量的醫(yī)療資源[1-2]。在成人中可發(fā)現(xiàn)較多的重度哮喘，且為非過敏性的，以女性居多[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，重度哮喘氣道表現(xiàn)為低Th2(Th2low)型的中性粒細(xì)胞性炎癥[4-5]。與嗜酸細(xì)胞性的高Th2(Th2high)型炎癥不同，吸入性糖皮質(zhì)激素對Th2low性哮喘的療效尚存爭議，有些研究認(rèn)為其對激素治療無反應(yīng)，而有些則認(rèn)為與Th2high反應(yīng)相同[6-9]。 而Th2high型哮喘往往具有特異質(zhì)和IgE介導(dǎo)的嗜酸細(xì)胞性炎癥，總體上激素治療有效，是最常見的病理亞型，多見于兒童早發(fā)型哮喘。為揭示成人重度哮喘的發(fā)病機(jī)制，本研究對成年發(fā)病的重度哮喘患者進(jìn)行了前瞻性研究，以明確該類患者的氣道炎癥類型、炎性介質(zhì)的水平及對激素的治療反應(yīng)。

對象與方法

一、研究對象

選擇2013 年1月至2016年1月在我院門診、急診及住院治療成人急性加重哮喘患者，共146例，其中晚發(fā)型哮喘患者輕中度哮喘患者104例為輕中度組，重度患者42例為重度組(28.7%)，全部均完成吸入或吸入加全身激素治療實(shí)驗(yàn)。選擇同期30例健康體檢者入為正常對照組。診斷和病情嚴(yán)重度分級(jí)按中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的支氣管哮喘防治指南及重度難治性哮喘的定義[10-11]。入 選 病 例 標(biāo)準(zhǔn) 為：大于18歲后首次發(fā)病的哮喘患者，無吸煙史或戒煙已1年以上，近6周內(nèi)無呼吸道感染 ，無其他嚴(yán)重疾患。入選者均簽署知情同意書。

二、研究方法

評估并記錄入選哮喘患者的基線情況，包括一般情況、病史、體征、胸部影像學(xué)檢查、肺功能、哮喘嚴(yán)重程度及哮喘癥狀控制評分(asthma control test, ACT)等。測定治療前誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞數(shù)量、分類及上清液白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、IL-8、IL-6、IL-5濃度，及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性，其后根據(jù)病情給予不同劑量糖皮質(zhì)激素吸入或全身激素治療，并輔以其他治療。治療4周后，再次對誘導(dǎo)痰進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)并復(fù)測IL-17等炎性介質(zhì)的濃度，復(fù)查患者肺功能、哮喘控制評分等。以痰液中嗜酸性粒細(xì)胞≥/<2%及中性粒細(xì)胞≥/<61%為界點(diǎn)定義嗜酸性或中性粒細(xì)胞性哮喘即[12-13]：嗜酸性粒細(xì)胞≥2%，中性粒細(xì)胞<61%為嗜酸粒細(xì)胞性哮喘；嗜酸性粒細(xì)胞<2%，中性粒細(xì)胞≥61%則為中性粒細(xì)胞性哮喘；而嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例均超過界點(diǎn)的，為混合性哮喘；兩種細(xì)胞比例均小于界點(diǎn)的則為寡細(xì)胞性哮喘。

依據(jù)文獻(xiàn)[14]方式進(jìn)行誘導(dǎo)痰處理。應(yīng)試者首先吸入沙丁胺醇200 μg，10 min后霧化吸入4%高滲鹽水40 ml，收集30 min內(nèi)全部痰液。去除唾液成分，痰液計(jì)量后加入相當(dāng)于痰液重量1.2倍體積的0.1%二硫蘇糖醇，震蕩15 min混勻。以離心半徑8 cm，2 000 r/min離心10 min，-70 ℃保存上清液用以檢測。細(xì)胞沉淀層涂片，瑞氏-吉姆薩染色后高倍鏡下計(jì)數(shù)300～500有核細(xì)胞(上皮除外)，計(jì)算有核細(xì)胞比例。

IL-6及IL-8(eBioscience公司，美國)、IL-17和IL-5(R&D公司，美國)的測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，參照試劑盒說明書操作。應(yīng)用免疫捕獲活性試劑盒(Calbiochem公司，美國)測定中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、臨床基線情況評估

哮喘患者的肺功能如FEV1及FVC等明顯低于正常對照者，輕中度哮喘組的特應(yīng)質(zhì)比例高于重度哮喘組及正常對照者。重度哮喘組的年齡和BMI較輕中度組及正常對照者為高(P<0.01)。正常對照組與哮喘組間合并疾患的數(shù)量無差異，但在重度哮喘組心血管及糖尿病的比例明顯高于輕中度組，見表1。

二、激素治療前后誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞及炎性介質(zhì)的改變

依據(jù)前述標(biāo)準(zhǔn)，激素治療前，輕中度組中有60例患者符合嗜酸細(xì)胞性哮喘診斷，寡細(xì)胞性20例，混合性為16例，而中性粒細(xì)胞性哮喘僅有8例。激素治療4周后，輕中度哮喘組中有12例嗜酸細(xì)胞性哮喘轉(zhuǎn)變?yōu)楣鸭?xì)胞性，另8例混合性則成為嗜酸細(xì)胞性，余分型保持不變。

重度哮喘組中，中性粒細(xì)胞性哮喘有17例，嗜酸粒細(xì)胞性16例，混合性6例，寡細(xì)胞性3例。有7例嗜酸性粒細(xì)胞哮喘治療后轉(zhuǎn)為混合性，2例轉(zhuǎn)為寡細(xì)胞性，僅有2例中性粒細(xì)胞性哮喘。3例混合性哮喘患者治療后轉(zhuǎn)為嗜酸細(xì)胞性哮喘。而3例寡細(xì)胞性哮喘治療后則均轉(zhuǎn)為中性粒細(xì)胞性哮喘，見表2。

表2 哮喘患者治療前后氣道炎癥分型

與正常對照組相比，無論輕中度還是重度哮喘，其氣道內(nèi)嗜酸細(xì)胞比例均明顯升高，同時(shí)輕中度哮喘氣道的嗜酸細(xì)胞比例高于重度哮喘，見表3。而輕中度組氣道的中性粒細(xì)胞比例則低于正常對照，但重度組的比例則明顯高于輕中度組及對照組(P<0.01)。經(jīng)皮質(zhì)激素治療后，輕中度組氣道的嗜酸細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例均較前明顯降低，而重度組治療后氣道嗜酸細(xì)胞比例顯著降低，但中性粒細(xì)胞比例卻輕度升高(P<0.05)。

無論輕中度還是重度哮喘，其氣道IL-5、6、8、17及彈性蛋白酶的濃度均明顯高于正常對照者。與輕度哮喘相比，治療前的重度哮喘患者痰液上清中IL-6、IL-8、IL-17濃度及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶含量明顯高于輕度組。相反，IL-5的濃度則明顯低于輕度組，見表4。激素治療后，輕度組IL-5、IL-6、IL-8、IL-17及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的濃度都明顯降低，而重度組僅IL-5濃度有顯著下降， IL-17等其余炎性介質(zhì)濃度均無改變。相關(guān)分析顯示，痰液中性粒細(xì)胞的比例與IL-17、IL-8的濃度呈正相關(guān)(r分別為0.545及0.360，P<0.01)，但與IL-17濃度相關(guān)性更大。而痰液中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的濃度與中性粒細(xì)胞所占比例及IL-17、IL-8濃度呈正相關(guān)(r分別為0.637、0.978、0.698，P<0.01)。

表1 哮喘患者一般資料和臨床基線評估的比較

注：a為輕中度組與正常組比較；b為重度組與輕中度組及正常組比較；無標(biāo)記者為三組間比較

表3 治療前后痰液中細(xì)胞成分的改變

注：a為與正常對照組比較，P<0.01；b為與輕中度組比較，P<0.01；c為治療后與治療前相比，P<0.05

表4 激素治療前后痰液中炎性介質(zhì)的變化

注：a為與正常對照組比較，P<0.01；b為與輕中度組比較，P<0.01；c為治療后與治療前相比，P<0.05

三、影響哮喘控制水平的相關(guān)因素

激素治療后，輕中度組的ACT評分及FEV1均較治療前獲得明顯提高，見表5，而重度組僅FEV1獲得輕度改善，ACT評分無好轉(zhuǎn)。直線回歸分析顯示，ACT評分與痰液中IL-17濃度、BMI呈負(fù)性關(guān)系(回歸方程ACT=28.323～0.267IL17-0.423BMI，P<0.01)，即隨著痰中IL-17濃度升高以及BMI增加，ACT評分逐漸降低。而肺功能FEV1占預(yù)計(jì)值的水平則與痰液中中性粒細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.546，P<0.01)，即隨著中性粒細(xì)胞比例的增加，哮喘患者FEV1占預(yù)計(jì)值的比例逐漸降低。

表5 治療前后ACT評分及FEV1的比較

討 論

重度哮喘是指需高劑量吸入激素并加用第二種控制性用藥，和/或全身性應(yīng)用皮質(zhì)激素方可控制或仍未能控制的哮喘[15]。近些年隨著對重度哮喘氣道炎癥分型及其代表的分子生物標(biāo)記物的深入研究發(fā)現(xiàn)，重度哮喘可以分成不同的亞型，如早發(fā)型過敏性哮喘、晚發(fā)型嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘和晚發(fā)型中性粒細(xì)胞型等。各種亞型所表現(xiàn)出的氣道炎癥特點(diǎn)迥然不同，但又有重疊之處[16]。正是不同分子生物機(jī)制導(dǎo)致的不同亞型，才使得哮喘對激素治療出現(xiàn)了不同的反應(yīng)，而且也使得臨床表現(xiàn)輕重不一。本研究收集的146余例患者中，重度哮喘占近1/3。這些重度哮喘患者不僅肺功能FEV1、ACT評分明顯低于輕中度患者，且激素治療后的病情改善程度亦不及后者。

本研究主要考察了臨床中最常見的成人晚發(fā)型哮喘，觀察其輕中度及重度哮喘的分布情況，并重點(diǎn)研究了其氣道炎癥類型以及對激素治療的反應(yīng)，以揭示該型重度哮喘的可能發(fā)病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)：①未治療的輕中度哮喘氣道炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞為主，而重度哮喘則中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞兩者皆有,且中性粒細(xì)胞居多；②激素吸入治療雖可控制重度哮喘患者以嗜酸細(xì)胞為主的Th2型氣道炎癥，但對中性粒細(xì)胞性炎癥無效，故哮喘的整體控制不佳。

研究表明，中性粒細(xì)胞是重度哮喘氣道炎癥的重要組成成分，是重度難治性哮喘的發(fā)病機(jī)制之一[17-18]。但也有學(xué)者認(rèn)為，哮喘氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量的增多，是由于治療中糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，使中性粒細(xì)胞凋亡延遲的結(jié)果，此外，吸煙的哮喘患者其氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量亦可明顯增加，故中性粒細(xì)胞在哮喘氣道炎癥中的作用尚存爭議[19-21]。本研究結(jié)果顯示，吸入激素僅降低了輕中度哮喘的氣道炎癥介質(zhì)水平，進(jìn)而提高哮喘控制水平及FEV1，但對重度哮喘，除嗜酸細(xì)胞及IL-5降低外，其余炎癥介質(zhì)的濃度及哮喘控制水平均無改善。這提示無論是嗜酸粒細(xì)胞性哮喘還是非嗜酸粒細(xì)胞性哮喘(中性粒細(xì)胞為主型)，吸入激素都可以對以嗜酸細(xì)胞為主的Th2型炎癥獲得良好的控制，但重度哮喘由于存在復(fù)雜的炎癥成分，特別是中性粒細(xì)胞性炎癥，故激素難以發(fā)揮作用，導(dǎo)致其臨床癥狀控制不佳，這在其它研究中也有證實(shí)[7-9]。需注意的是，重度組哮喘經(jīng)4周高劑量激素吸入及部分患者的全身皮質(zhì)激素治療后，氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞比例有輕度升高，且炎癥表型集中向中性粒細(xì)胞性轉(zhuǎn)化，提示大劑量吸入或全身激素的應(yīng)用，可能會(huì)引起氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的凋亡延遲，導(dǎo)致氣道炎癥無改善，是重度哮喘控制不佳的一個(gè)可能原因。

基于對傳統(tǒng)Th1/Th2理論的突破，新的研究認(rèn)為，Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其代表性細(xì)胞因子IL-17、IL-10等在哮喘的發(fā)病中起到重要作用，特別是Th17分泌的IL-17，作為前炎癥介質(zhì)可以促進(jìn)IL-6、IL-8的高表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞向氣道內(nèi)聚集形成Th2low型炎癥，并參與氣道的重宿，是重度難治性哮喘的重要發(fā)病機(jī)制[22-24]。本研究中，治療前重度哮喘患者痰液內(nèi)IL-17濃度明顯增高，且氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞比例亦與IL-17濃度呈正相關(guān)，激素治療后IL-17仍未能降低，導(dǎo)致哮喘的臨床控制如ACT評分、FEV1水平未能提高，因此氣道內(nèi)IL-17是影響重度哮喘預(yù)后的重要指標(biāo)[24-25]。

重度難治性哮喘的標(biāo)志就是激素治療效果不佳[11]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17水平升高是重度哮喘激素治療不敏感的重要發(fā)病機(jī)制[22-23]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，地塞米松可顯著抑制淋巴細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，但對IL-17的產(chǎn)生無作用[26]。且地塞米松在體外甚至可促進(jìn)和維持Th17 的分化，增加IL-17的表達(dá)[27]。IL-17除可趨化中性粒細(xì)胞外，還可上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體β的表達(dá)，導(dǎo)致外周血單個(gè)核細(xì)胞的激素抵抗。而維生素D能以非激素依賴的方式降低重度哮喘患者IL-17的產(chǎn)生[28-29]。在本研究中，輕中度組哮喘氣道內(nèi)IL-17經(jīng)激素治療后濃度較前降低，ACT評分及FEV1亦獲得改善，而重度哮喘則無變化，系由于輕中度哮喘氣道炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞為主，故激素可取得良好的臨床療效如FEV1和ACT的改善。至于為何激素能降低輕中度哮喘氣道內(nèi)IL-17濃度，而重度哮喘則未然，尚不清楚其機(jī)制，值得深入探討。

針對哮喘不同氣道炎癥亞型對激素治療的不同反應(yīng)及相應(yīng)的分子機(jī)制，目前已開發(fā)出了多種分子生物治療方式，雖尚不能完全解決臨床問題，但已顯現(xiàn)出廣闊的前景。如抗IL-5特異性抗體(Mepolizumab)，可明顯降低重度難治性嗜酸粒細(xì)胞型哮喘的急性加重發(fā)生率，改善患者生活質(zhì)量[30-32]。此外，該抗體還可降低激素依賴型哮喘患者的全身激素用量，且減少因降低激素用量而導(dǎo)致的急診就醫(yī)、住院率等[33]。而針對中性粒細(xì)胞性炎癥的抗IL-17單克隆抗體Brodalumab， 能阻止IL-17相關(guān)的下游中性粒細(xì)胞的募集，并可使部分患者FEV1有20%以上的改善，使無癥狀天數(shù)和哮喘控制得到提升[34]。白細(xì)胞表面的CXCR受體通過與Th1途徑的細(xì)胞因子結(jié)合，可活化和募集中性粒細(xì)胞至炎癥部位，其拮抗劑SCH527123可選擇性結(jié)合CXCR2，能使重度哮喘患者痰液的中性粒細(xì)胞數(shù)平均減少36%，并減少哮喘癥狀的惡化、PEF的降低及緩解性用藥的使用[35-36]。

總之，探討哮喘氣道炎癥分型的最終目的是指導(dǎo)治療方式的選擇，對任何新出現(xiàn)的治療方式都不應(yīng)千篇一律不加區(qū)分地使用，而應(yīng)遵循哮喘分型和生物標(biāo)記物的檢測，這樣才能提高重度哮喘的控制水平。

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