QuEChERS結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定畜禽糞便中多種抗生素殘留

曾 橋， 呂生華， 李 祥， 李 卓， 吳雪艷， 蘇偉鵬， 王麗萍

(1.陜西科技大學 輕工科學與工程學院， 陜西 西安 710021； 2.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 3.陜西科技大學 化學與化工學院， 陜西 西安 710021； 4.西安市食品藥品檢驗所， 陜西 西安 710054)

0 引言

近年來，隨著經濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，我國對肉制品的消費量不斷增加，以豬肉、牛肉、羊肉和禽肉為代表的肉品產量逐年增長，從而帶動了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展.目前，我國已成為世界上最大的畜禽養(yǎng)殖國，統(tǒng)計數據表明，2018年全國豬牛羊禽肉產量已達8517萬噸.不斷擴大的畜禽養(yǎng)殖規(guī)模對環(huán)境造成了巨大的壓力，據估算，我國每年需要處理的養(yǎng)殖畜禽糞便在40億噸以上.獸用抗生素在畜禽養(yǎng)殖過程中主要用作抗菌劑和促生長劑而直接添加到飼料中，然而，僅少部分抗生素參與體內代謝，大部分以原藥的形式隨糞尿直接排出體外[1].由于我國畜禽糞便產量巨大，且大部分養(yǎng)殖場缺乏必要的糞污處理措施，大量的糞便被隨意處置而進入農田土壤和水環(huán)境中，不僅帶來了惡臭等生態(tài)環(huán)境污染，而且隨糞便排放到環(huán)境中的抗生素還會通過食物鏈進入人體，進而損害人體健康.

高溫堆肥是實現畜禽糞便無害化和資源化的有效途徑，通過堆肥一方面將糞便中的多種成分轉化為穩(wěn)定和易于被植物吸收利用的養(yǎng)分，同時，堆肥還有助于畜禽糞便中有害成分的降解和去除.勾長龍等[1]研究發(fā)現，高溫堆肥能顯著降低豬糞中四環(huán)素類抗生素的含量，且對四環(huán)素類抗性基因有一定的消減作用.林輝等[2]研究結果表明，雞糞中磺胺藥在高溫堆肥14 d內降解率達100%.因此，開展對畜禽糞便以及畜禽糞便堆肥過程中基質的多種殘留抗生素的檢測研究對于降低生態(tài)污染風險，保護環(huán)境具有重要意義.

高效液相色譜及液相色譜-串聯(lián)質譜是目前抗生素檢測的主要方法[3,4]，此外，還有微生物法[5]、免疫分析技術(包括酶聯(lián)免疫[5,6]、膠體金免疫層析[7])以及電化學免疫傳感器[8,9]等)、可視化蛋白芯片分析技術[10]、高效毛細管電泳法[11]等.高效液相色譜作為常用方法，其檢測器對干擾物屏蔽效果不佳，為了達到理想結果，往往需要更高的前處理技術和色譜分離技術.液相色譜-串聯(lián)質譜較高效液相色譜法抗干擾能力強，靈敏度高，檢測快速，定量和定性分析更準確[12,13].樣品前處理是液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測抗生素殘留的關鍵步驟，QuEChERS法具有前處理簡單、較高的回收率、結果準確、減少操作過程中人與有害溶劑的接觸等優(yōu)點[14]，目前已在食品抗生素殘留檢測中得到了廣泛的應用，但用于檢測畜禽糞便中抗生素殘留的報道較少.

本文采用QuEChERS結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，建立畜禽糞便中多種殘留抗生素的定性定量測定方法，該方法準確，靈敏度高，操作簡單，重復性好，具有良好的應用前景和廣泛的應用范圍.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸土霉素(≥ 98.75%)、鹽酸四環(huán)素(≥ 99.60%)、磺胺嘧啶(≥ 99.22%)、諾氟沙星(≥ 99.70%)，購于上海阿拉丁化學試劑有限公司；磺胺甲嘧啶(≥ 99.70%)、氧氟沙星(≥ 95.70%),購于德國DR.E公司.

乙腈、甲醇,色譜純，Fisher公司；乙二胺四乙酸二鈉(色譜級)、甲酸、乙酸銨(質譜級),上海阿拉丁化學試劑有限公司；QuEChERS Cleanert LipoNo管,天津博納艾吉爾科技有限公司.

1.2 儀器與設備

Ulimate3000-TSQ Quantiva 超高液相色譜-質譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；KH5200DE醫(yī)用數控超聲波清洗機，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Milli-Q Integral 5 純水機，密理博有限公司；ME204E 萬分之一電子天平、MS105 十萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；TL5R 離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；FD5-2.5 真空冷凍干燥機，美國SIM國際集團有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別準確稱取各抗生素標準品適量，用甲醇溶解，配制500μg/mL的單一標準品儲備液，-18 ℃保存.準確量取鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素單一標準品儲備液各1 mL，量取磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星單一標準品儲備液各0.1 mL，共同置于10 mL棕色容量瓶內，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為50μg/mL(鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素)和5μg/mL(磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星)的混合標準品儲備液，進一步吸取混合標準品儲備液適量，用甲醇逐級稀釋得系列濃度混合標準品工作液.

1.3.2 供試品溶液的制備

新鮮豬糞取自西安周邊養(yǎng)殖場，經冷凍干燥后研磨并混合均勻，準確稱取0.5 g干燥豬糞樣品，置于50 mL離心管中，加入0.1 mol/L EDTA-2Na溶液2 mL，渦旋1 min，繼續(xù)加入乙腈8 mL，渦旋1 min，超聲處理15 min后，于10 000 r/min離心10 min，取上清液3 mL加入Cleanert LipoNo凈化管中，振搖1 min后，靜置1 min，進一步取0.1 mL上清液加2.9 mL水，渦旋1 min，稍靜置后取0.5 mL上清液加2 mL水，渦旋1 min，用0.22μm聚醚砜微孔濾膜濾過，置于進樣瓶中，待分析.

?M.Sebastiano Erizzo.Discorso sopra le medaglie degli antichi：con la dichi aratione delle monete consulari e delle medaglie degli Imperadori Romani,Venice (Varisco&Paganini),1559;Trattato di messer Sebastiano Erizzo,dell'istrumento et via inventeur de gli antichi,Venice,1554.

1.3.3 色譜-質譜條件

(1)色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Scientific C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm)；流動相A：0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨水溶液(V/V)；流動相B：0.1%甲酸乙腈(V/V)；梯度洗脫程序：0～1.0 min，5% B、1.0～1.1 min，5%～15% B、1.1～9.5 min，15%～75% B、9.5～9.6min，75% ～95% B、9.6～11.5 min，95% B、11.5～11.6 min，95%～5% B、11.5～11.6 min，5% B、流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2μL.

(2)質譜條件

采用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應監(jiān)測(MRM)；霧化氣：N2(≥ 99.9%)；碰撞氣：Ar(≥ 99.99%)；霧化溫度：300 ℃ ；離子傳輸管溫度：350 ℃ ；毛細管電壓：3.5 kV；鞘氣流速：5 L/min；輔助氣流速：8 L/min.各目標抗生素保留時間、離子對、碰撞能量、傳輸電壓等質譜條件見表1所示.

2 結果與討論

2.1 質譜條件優(yōu)化

配制6種目標抗生素混合標準溶液，以在線流動注射方式進樣，分別采用正負離子掃描模式進行檢測，發(fā)現在正離子模式下進行檢測時[M+H]+峰響應強度大且穩(wěn)定.給予母離子不同碰撞能量，對子離子進行優(yōu)化，根據響應強度選擇定量和定性離子[15].優(yōu)化后的質譜參數見表1.

2.2 流動相的選擇

配制適當濃度6種目標抗生素混合標準溶液，分別考察0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸乙腈和水-乙腈3種流動相體系對6種目標抗生素的分離效果及質譜響應情況.結果表明，在正離子模式下，采用含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸乙腈作為流動相，峰型良好，保留時間穩(wěn)定，質譜相應強度較另兩種流動相體系大.因此，選擇含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸乙腈作為流動相，在該條件下，6種目標抗生素提取離子流圖見圖1所示.

(a)鹽酸土霉素

(b)鹽酸四環(huán)素

(c)磺胺嘧啶

(d)磺胺甲嘧啶

(e)氧氟沙星

(f)諾氟沙星圖1 各目標抗生素提取離子流圖

2.3 方法學評價

2.3.1 線性相關性、檢測下限和定量下限

取“1.2”節(jié)中系列濃度混合標準品工作液，按“1.3.3”節(jié)中規(guī)定的色譜條件進行測定，以各抗生素標準品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，確定相關系數(R2)，以信噪比S/N≥3 和S/N≥10 確定檢測下限(LOD)和定量下限(LOQ)，結果見表2所示.從表2可以看出，6種目標抗生素在各自線性范圍內線性關系良好，R2在0.995 9～0.999 4之間.

表2 6種目標抗生素線性范圍、回歸方程、相關系數及檢測下限、定量下限

2.3.2 精密度試驗

連續(xù)進樣6次，分別記錄峰面積和保留時間，計算鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星保留時間和峰面積的RSD(n=6)，結果見表3所示，精密度良好，符合測定要求.

表3 精密度試驗

2.3.3 回收率和精密度

精密稱取空白豬糞樣品，分別在各抗生素低、中、高三個水平下進行加樣回收實驗，按“1.3.2”節(jié)中要求進行處理后進行測定，計算各目標抗生素回收率和RSD，結果見表4所示.6種目標抗生素平均回收率在69.7%～119.2%，相對偏差為0.7%～10.0%(n=6)，說明方法回收率和精密度良好，能滿足豬糞中抗生素殘留的測定要求.

表4 6種目標抗生素回收率和精密度

2.3.4 重復性試驗

精密稱取豬糞抗生素陽性樣品6份，按“1.3.2”節(jié)中規(guī)定的方法處理，得供試品溶液，測定條件依“1.3.3”節(jié)中規(guī)定，檢出鹽酸土霉素490.33 mg·kg-1(RSD=3.47%)，鹽酸四環(huán)素611.02 mg·kg-1(RSD=3.45%)，磺胺嘧啶221.70 mg·kg-1(RSD=7.24%)，磺胺甲嘧啶227.30 mg·kg-1(RSD=6.35%)，氧氟沙星192.14 mg·kg-1(RSD=3.81%)，諾氟沙星160.85 mg·kg-1(RSD=6.24%)，結果表明該方法重復性良好.

2.4 實際樣品測定

在西安周邊8個生豬養(yǎng)殖場采集豬糞樣本，采集好的樣本保存于加冰袋的泡沫盒中，并于4 h內儲存于-20 ℃冰箱，采用本實驗所建立的方法進行分析.結果表明，鹽酸土霉素和鹽酸四環(huán)素檢出率均為100%，磺胺嘧啶檢出率為62.5%，氧氟沙星檢出率為37.5%，諾氟沙星檢出率為12.5%，磺胺甲嘧啶未檢出.其中，以豬糞干基計，殘留抗生素含量較高為鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素，含量范圍分別為67.82～719.74 mg·kg-1和17.48～552.74 mg·kg-1.

從結果可以發(fā)現，目標抗生素在采集的豬糞樣本中檢出率較高，且殘留量也較大.畜禽糞便的隨意排放易導致殘留的抗生素對水體和環(huán)境的污染，并最終通過食物鏈進入人體內，對人類健康造成危害.此外，積累在環(huán)境中的抗生素作用于微生物，極易導致環(huán)境中耐藥細菌和抗性基因的產生，從而對整個生態(tài)環(huán)境帶來風險.因此，積極開展畜禽糞便中殘留抗生素的監(jiān)測和治理具有非常重要的意義.

3 結論

QuEChERS技術是基于分散固相萃取建立起來的一種樣品前處理技術，具有萃取凈化步驟簡單，檢測范圍廣，回收率高，分析速度快，溶劑使用量少等優(yōu)點[16,17].近年來在農產品及食品加工品檢測等方面應用廣泛，并逐步擴大到環(huán)境、紡織等行業(yè).本實驗針對畜禽糞便中殘留的常見3類(喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類)6種抗生素，采用QuEChERS結合UPLC-MS/MS法對其進行定性和定量分析.

結果表明，新鮮豬糞樣品經冷凍干燥，乙腈提取，Cleanert LipoNo管凈化，然后采用UPLC-MS/MS檢測，該方法較HLB固相萃取柱凈化前處理方法簡單，分析速度快，準確度和精密度均良好，可用于畜禽糞便中常見抗生素殘留的分析檢測.此外，本方法在凈化過程中所用Cleanert LipoNo為大顆粒填料，無需離心，從而進一步簡化了前處理操作[18]，適合大量樣品的處理，具有較好的發(fā)展前景.