新型流感病毒快速實(shí)驗(yàn)室鑒定研究進(jìn)展

王蔚+盧洪洲

2017年入冬以來(lái)，我國(guó)南北方省份流感活動(dòng)水平上升較快，當(dāng)前處于冬季流感流行高峰水平。全國(guó)流感監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，流感樣病例就診百分比和流感病毒檢測(cè)陽(yáng)性率均顯著高于過(guò)去三年同期水平，流感活動(dòng)水平仍呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)，本次冬季流感活動(dòng)強(qiáng)度要強(qiáng)于往年。2018年1月，為有效應(yīng)對(duì)流感疫情，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委和國(guó)家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于做好2018年流感防治工作的通知》和《流行性感冒診療方案（2018年版）》。

2018年1月8日，由浙江大學(xué)李蘭娟院士領(lǐng)銜、上海市公共衛(wèi)生臨床中心盧洪洲教授等專(zhuān)家共同參與完成的“以防控人感染H7N9禽流感為代表的新發(fā)傳染病防治體系重大創(chuàng)新和技術(shù)突破”項(xiàng)目獲“2017年度國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)特等獎(jiǎng)”。這是該獎(jiǎng)項(xiàng)設(shè)立以來(lái)，我國(guó)醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)、教育行業(yè)“零”的突破。該項(xiàng)目在發(fā)現(xiàn)新病原、確認(rèn)傳染源、明確發(fā)病機(jī)制、有效臨床救治、研發(fā)新型疫苗和診斷技術(shù)等方面取得了重大創(chuàng)新和技術(shù)突破。

流感防控的諸多環(huán)節(jié)中，流感病毒的快速鑒定至關(guān)重要，但卻一直是個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。為此，本刊特向上海市公共衛(wèi)生臨床中心相關(guān)專(zhuān)家約稿，希望廣大醫(yī)藥工作者，特別是臨床一線門(mén)急診醫(yī)護(hù)人員對(duì)流感疫情引起高度重視，并對(duì)相關(guān)檢測(cè)鑒定技術(shù)有所了解。

摘 要 流感病毒是新發(fā)突發(fā)傳染病防控重點(diǎn)，而臨床標(biāo)本中微量未知新型流感病毒快速鑒定一直是個(gè)難點(diǎn)。本文介紹最新高通量分子診斷技術(shù)研究進(jìn)展，通過(guò)組合應(yīng)用熒光多重PCR、consensus PCR、一代測(cè)序和二代測(cè)序技術(shù)等不同技術(shù)，不經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)分離，快速鑒定臨床標(biāo)本中新型甲型流感病毒的技術(shù)流程。

關(guān)鍵詞 新型甲型流感病毒 高通量分子診斷技術(shù) 病原體快速鑒定體系

中圖分類(lèi)號(hào)：R511.7； R446 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）03-0001-04

Research progress on rapid laboratory identification of novel influenza A virus

WANG Wei*， LU Hongzhou**

（Shanghai Public Health Clinical Center， Fudan University， Shanghai 201508， China）

ABSTRACT Influenza virus is a key pathogen for the prevention and control of the emerging infectious diseases， and the rapid identification of a new novel genotype of influenza virus in clinical specimens has been a difficult problem. This paper introduces the research progress of new high-throughput molecular diagnostic techniques， and the procedure of rapid identification of novel influenza A virus from clinical samples without cell culture by using in combination of fluorescence multiple PCR， consensus PCR and next-generation sequencing technology.

KEY WORDS novel influenza A virus； high throughput molecular diagnosis technology； rapid identification system of pathogens

流感病毒是一種重要的呼吸道傳染病原體。每年流行季可導(dǎo)致數(shù)十萬(wàn)人死亡。不僅如此，人類(lèi)歷史上多次發(fā)生流感大流行，造成百萬(wàn)甚至千萬(wàn)人死亡。進(jìn)入2000年以來(lái)，新型甲型流感病毒如pamH1N1病毒在2009年造成全球大流行，新發(fā)現(xiàn)H5N1、H7N9、H5N6和H10N8等禽流感病毒在全球或局部地區(qū)不斷出現(xiàn)人感染病例[1-5]。因此，流感全球大暴發(fā)的潛在威脅一直存在，是新發(fā)突發(fā)傳染病防控的重點(diǎn)。

流感病毒屬于正黏病毒科，根據(jù)基因組和抗原特性分為甲乙丙三個(gè)屬。甲型流感病毒為有包膜負(fù)鏈RNA病毒，基因組分成8個(gè)節(jié)段，分別編碼11個(gè)病毒蛋白（PB2、PB1、PBl-F2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NEP）。其中，血凝素HA蛋白和神經(jīng)酰胺酶NA蛋白是病毒的表面抗原蛋白，根據(jù)各自抗原特性和序列特征細(xì)分成不同亞型，已知HA蛋白常見(jiàn)亞型有18種，NA蛋白有11種。甲型流感病毒亞型命名是根據(jù)不同HA和NA蛋白的組合。水禽類(lèi)是流感病毒的貯存宿主，攜帶了幾乎所有18種HA和11種NA亞型病毒，人感染的流感病毒亞型主要為H1、H2、H3和N1、N2。H1N1和H3N2流感病毒是人季節(jié)性流感。當(dāng)人流感病毒與某個(gè)禽流感病毒發(fā)生重組產(chǎn)生新病毒，或者某個(gè)禽流感病毒通過(guò)自身點(diǎn)突變的積累而獲得感染人體細(xì)胞的能力，而人類(lèi)對(duì)這些新病毒并沒(méi)有免疫能力，很可能會(huì)再次發(fā)生流感大流行。

新型流感病毒疫情出現(xiàn)時(shí)，若實(shí)驗(yàn)室在第一時(shí)間確診病原體，對(duì)于患者的及時(shí)救治、有效防控措施的制定等都是至關(guān)重要的。目前全新分子生物學(xué)技術(shù)在此領(lǐng)域的應(yīng)用使新病原診斷的周期不斷縮短，靈敏度和準(zhǔn)確性也不斷提高。

2013年3月初，上海市公共衛(wèi)生臨床中心在會(huì)診上海市第五人民醫(yī)院一位不明原因重癥肺炎患者時(shí)，規(guī)范地留取臨床標(biāo)本，按照未知呼吸道病原體鑒定流程，采用熒光多重PCR、consensus PCR、一代測(cè)序和二代測(cè)序技術(shù)，從臨床標(biāo)本中直接確定病原體為一種新型甲型H7N9禽流感病毒，并獲得臨床毒株全長(zhǎng)基因組序列，對(duì)毒株的耐藥位點(diǎn)進(jìn)行耐藥分析[6]。通常新病毒確診需要通過(guò)雞胚或細(xì)胞接種分離得到毒株然后測(cè)序得到毒株的全基因組序列[2]。由于病毒雞胚/細(xì)胞分離株不可避免地受到培養(yǎng)過(guò)程中環(huán)境選擇的壓力，導(dǎo)致毒株發(fā)生適應(yīng)性突變以及優(yōu)勢(shì)毒株優(yōu)先得到擴(kuò)增，因此不能充分反映臨床標(biāo)本中病毒群落的生物學(xué)特性。為了進(jìn)一步研究病毒從禽到人跨種傳播和毒力變化的原因、評(píng)估抗病毒藥物的療效以及預(yù)測(cè)病毒人際傳播的潛在可能，從患者臨床標(biāo)本中直接得到病毒全基因組序列和遺傳多態(tài)性信息已經(jīng)成為被廣泛接受的最新研究策略[4-5]。endprint

本文重點(diǎn)介紹采用組合應(yīng)用不同高通量分子診斷技術(shù)的策略，直接從臨床標(biāo)本入手，快速鑒定新型甲型流感病毒的技術(shù)流程。該流程包括三個(gè)步驟：流感病毒病毒診斷、甲型流感病毒分型和新型流感病毒鑒定（圖1）。

1 甲型流感病毒檢測(cè)

1.1 核酸檢測(cè)

流感病毒與鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等10多種病原體引發(fā)的呼吸道感染臨床癥狀極為相似且流行季節(jié)重疊。因此，對(duì)急性呼吸道感染患者的臨床標(biāo)本（鼻咽擦拭子、痰液、支氣管肺泡灌洗液）需要進(jìn)行流感病毒和其他已知常見(jiàn)呼吸道病原體初步篩查。篩查采用分子檢測(cè)方法，以不同病毒基因各自高度保守序列為靶序列，設(shè)計(jì)一系列引物和探針，各個(gè)單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)片段大小或熒光信號(hào)篩查陽(yáng)性標(biāo)本[7-8]。

以Luminex和Perkin Elmer公司分別研發(fā)的“液相懸浮芯片”、BioFire公司研發(fā)的FilmArray等為代表的高通量病原體核酸檢測(cè)技術(shù)，采用多重PCR或多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增病毒核酸，再結(jié)合下游不同雜交技術(shù)的策略[9-10]。與傳統(tǒng)單個(gè)病原體特異性PCR相比，這些技術(shù)一次可同時(shí)檢測(cè)10多種甚至幾十種病原，為及時(shí)快速地篩查鑒定病原體提供了有效的手段，但是檢測(cè)成本較高和配套設(shè)備復(fù)雜昂貴等因素限制了這些技術(shù)在臨床應(yīng)用上的推廣。

1.2 血清學(xué)診斷

患者急性期（發(fā)病5 d內(nèi)）血清和恢復(fù)期血清（病程2～4周）雙份血清，在相同條件下做血凝抑制（hemaglutination inhibition， HI）試驗(yàn)可作為流感病毒感染輔助診斷，但是診斷的靈敏性和特異性較差不適用于流感病毒快速診斷。

1.3 病毒分離與鑒定

流感病毒確診的金標(biāo)準(zhǔn)是毒株分離培養(yǎng)。流感病毒分離培養(yǎng)采用雞胚或猴胚腎細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）接種臨床呼吸道標(biāo)本，3～4 d后取雞胚囊液或細(xì)胞上清液做血凝實(shí)驗(yàn)或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)確定陽(yáng)性結(jié)果。該方法操作要求高且耗時(shí)久，不適用于流感病毒的快速診斷。

2 甲型流感病毒分型

流感病毒是高突變病毒，其基因組的復(fù)制需要病毒PA、PB1和PB2蛋白組成的病毒RNA聚合酶復(fù)合物，復(fù)制后的基因節(jié)段與新合成的病毒蛋白裝配成子代病毒。由于病毒聚合酶缺乏5à3端核酸校正功能，因此在RNA復(fù)制過(guò)程中易出現(xiàn)錯(cuò)配，導(dǎo)致子代病毒基因組和病毒蛋白氨基酸突變。突變累積會(huì)造成病毒蛋白抗原性改變，產(chǎn)生病毒對(duì)人體免疫逃逸，是人季節(jié)性流感流行的原因。同時(shí)，當(dāng)兩種以上不同亞型的流感病毒感染同一宿主細(xì)胞時(shí)，各自基因節(jié)段在子代病毒裝配過(guò)程中發(fā)生重配，從而產(chǎn)生新型重組病毒。因此，流感病毒分型對(duì)病毒的流行監(jiān)測(cè)具有重要意義。

流感病毒基因組有8個(gè)節(jié)段，其中M和NP基因高度保守，一般作為甲型流感病毒的型別鑒定。HA和NA基因則用于人季節(jié)性甲型流感病毒（H1N1和H3N2）分型。

HA和NA基因分型可采用傳統(tǒng)PCR或熒光定量PCR方法，利用已知基因序列信息進(jìn)行多序列的比對(duì)（alignment），找出基因組中合適的區(qū)域段作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)H1～H18和N1～N11不同亞型特異性引物和探針[11-12]。由于流感病毒具有高突變率，引物選擇和數(shù)據(jù)分析較為復(fù)雜。隨著病毒變異不斷積累導(dǎo)致靶序列的較大變化，需要相應(yīng)地更新或更換檢測(cè)引物。

3 新型流感病毒鑒定

由于新型甲型流感病毒是不同亞型甲型流感病毒的8個(gè)基因節(jié)段重組而來(lái)，因此新型甲型流感病毒的鑒定需要確定8個(gè)片段基因序列，通過(guò)序列比對(duì)和進(jìn)化分析確定病毒亞型。

為獲得病毒8個(gè)基因節(jié)段序列，研究人員建立了基于保守序列的PCR擴(kuò)增（consensus PCR）。首先，通過(guò)序列比對(duì)找到各個(gè)相對(duì)保守的序列區(qū)域設(shè)計(jì)PCR通用引物。用consensus PCR擴(kuò)增所獲片段，通過(guò)直接測(cè)序得到基因序列[13]。該方法特異性強(qiáng)，但是要求臨床標(biāo)本中病毒有較高滴度，而且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。

近年發(fā)展起來(lái)的高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing， HTS）能夠更簡(jiǎn)單更全面檢測(cè)病毒全基因組序列，它通過(guò)導(dǎo)入特異性接頭序列，對(duì)每個(gè)輸入（input）的臨床標(biāo)本中的DNA分子進(jìn)行大規(guī)模平行擴(kuò)增和合成測(cè)序，然后通過(guò)生物信息分析，將所得每條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)、拼接和組裝，從而完成病毒鑒定[14]。它的最大檢測(cè)優(yōu)勢(shì)在于不需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，直接對(duì)臨床標(biāo)本中的核酸池（pool）進(jìn)行測(cè)序；而它的弱點(diǎn)在于檢測(cè)特異性較低，主要原因是建庫(kù)過(guò)程中無(wú)法完全去除宿主基因組和環(huán)境微生物基因組的污染。另外，它必需有專(zhuān)業(yè)生物信息平臺(tái)的支持，才能對(duì)產(chǎn)生的海量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行后期處理。因此，高通量測(cè)序技術(shù)較適用于無(wú)法體外培養(yǎng)分離的病毒、高度變異病毒、重組病毒以及新病毒的鑒定和研究[14]。

目前高通量技術(shù)平臺(tái)有3家，分別由Roche、ABI和Illumina公司開(kāi)發(fā)。相對(duì)于一代Sanger測(cè)序法，這些技術(shù)被統(tǒng)稱(chēng)為二代測(cè)序技術(shù)。三家研發(fā)了不同的化學(xué)擴(kuò)增體系、測(cè)序信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和分析軟件，其各自具體原理本文不再贅述[14]。三家平臺(tái)各有所長(zhǎng)，根據(jù)其通量、平均讀長(zhǎng)、準(zhǔn)確性和使用成本的差異，適合于不同研究應(yīng)用。對(duì)于新病原鑒定，一個(gè)HTS平臺(tái)最重要技術(shù)指標(biāo)是：①模板DNA最低起始量；②測(cè)序時(shí)間和成本；③測(cè)序通量；④測(cè)序讀長(zhǎng)。相較于商業(yè)化測(cè)序服務(wù)公司配備大型HTS平臺(tái)，臨床診斷實(shí)驗(yàn)室多選擇小型HTS平臺(tái)包括Miseq和Ion Torrent PGM，直接從單個(gè)臨床標(biāo)本中獲得病毒全基因組序列。

值得一提的是，盡管高靈敏度的檢測(cè)方法可以幫助發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中的病毒核酸，但如何確認(rèn)被檢測(cè)到的微生物是導(dǎo)致疾病或疫情暴發(fā)的病原體，始終是病原體鑒定中的核心問(wèn)題[15]。新病原體與導(dǎo)致疾病之間因果關(guān)系的論證需要遵從科赫（Koch）法則。endprint

4 結(jié)語(yǔ)

臨床標(biāo)本中微量已知病毒的鑒定通常根據(jù)其形態(tài)學(xué)、特異性抗原和特定基因序列，經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)分離，采用血清學(xué)和分子學(xué)檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是，未知新病毒的檢測(cè)一直是個(gè)難點(diǎn)。新型流感病毒的及時(shí)鑒定對(duì)于臨床救治和傳染病疫情控制至關(guān)重要，新的快速、高通量、高敏感性和高特異性的檢測(cè)鑒定技術(shù)正在不斷地被研發(fā)和應(yīng)用。正在研發(fā)和驗(yàn)證之中的還包括納米金顆粒技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、三代測(cè)序技術(shù)與現(xiàn)有的核酸診斷技術(shù)的聯(lián)用等。未來(lái)，隨著這些技術(shù)的不斷成熟、標(biāo)準(zhǔn)化和低成本化，有望在臨床診斷和疫情防控中被大規(guī)模應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] Tran TH， Nguyen TL， Nguyen TD， et al. Avian influenza A（H5N1） in 10 patients in Vietnam[J]. N Engl J Med， 2004， 350（12）： 1179-1188.

[2] Gao R， Cao B， Hu Y， et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J]. N Engl J Med， 2013， 368（20）： 1888-1897.

[3] Gao HN， Lu HZ， Cao B， et al. Clinical findings in 111 cases of influenza A （H7N9） virus infection[J]. N Engl J Med， 2013， 368（24）： 2277-2285.

[4] Yang ZF， Mok CK， Peiris JS， et al. Human infection with a novel avian influenza A （H5N6） virus[J]. N Engl J Med， 2015， 373（5）： 487-489.

[5] Chen H， Yuan H， Gao R， et al. Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case of avian influenza A H10N8 virus infection： a descriptive study[J]. Lancet， 2014， 383（9918）： 714-721.

[6] Hu Y， Lu S， Song Z， et al. Association between adverse clinical outcome in human disease caused by novel influenza A H7N9 virus and sustained viral shedding and emergence of antiviral resistance[J]. Lancet， 2013， 381（9885）： 2273-2279.

[7] Wang W， Cavailler P， Ren P， et al. Molecular monitoring of causative viruses in child acute respiratory infection in endemo-epidemic situations in Shanghai[J]. J Clin Virol， 2010， 49（3）： 211-218.

[8] Wang W， Ren P， Sheng J， et al. Simultaneous detection of respiratory viruses in children with acute respiratory infection using two different multiplex reverse transcription-PCR assays[J]. J Virol Methods， 2009， 162（1-2）： 40-45.

[9] Luminex. Targeted and syndromic molecular diagnostics testing[EB/OL]. [2018-01-25]. http：//www.luminexcorp.com/ clinical/infectious-disease.

[10] Biofire. Syndromic testing： the right test， the first time[EB/ OL]. [2018-01-25]. http：//www.biofiredx.com.

[11] WHO. Diagnostics for influenza publications， 2010–2011[EB/ OL]. [2018-01-25]. http：//www.who.int/influenza/resources/ research/RA_Progress_Report_App11.pdf？ua=1.

[12] Wang W， Ren P， Mardi S， et al. Design of multiplexed detection assays for identification of avian influenza A virus subtypes pathogenic to humans by SmartCycler real-time reverse transcription-PCR[J]. J Clin Microbiol， 2009， 47（1）： 86-92.

[13] Hoffmann E， Stech J， Guan Y， et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J]. Arch Virol， 2001， 146（12）： 2275-2289.

[14] Qui？ones-Mateu ME， Avila S， Reyes-Teran G， et al. Deep sequencing： becoming a critical tool in clinical virology[J]. J Clin Virol， 2014， 61（1）： 9-19.

[15] Firth C， Lipkin WI. The genomics of emerging pathogens[J]. Annu Rev Genomics Hum Genet， 2013， 14： 281-300.endprint