硫酸葡聚糖對低離子強度下羅非魚肌球蛋白熱變性聚集的抑制及其機制

李 婷 周春霞 馮 瑞 洪鵬志

(1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088)

肌球蛋白是魚類肌肉蛋白的主要成分，該蛋白以2個球狀頭部和1個棒狀尾部為骨架構成了約160 nm的長型不對稱結構[1]。肌球蛋白為鹽溶性蛋白，在高鹽溶液(600 mmol/L KCl)中，肌球蛋白以單體或可溶性寡聚體[2]形式分散在溶液中，體系熱穩(wěn)定性較好，這在食品的保水性和質地方面起著非常重要的作用。而在低鹽溶液(<200 mmol/L KCl)中，肌球蛋白不易溶解[2]，受熱易發(fā)生變性聚集并伴有弱凝膠形成的趨勢，不利于水產(chǎn)品的精深加工。熱穩(wěn)定性是蛋白質重要的功能特性，通過添加化學助劑來改善蛋白質熱穩(wěn)定性的研究繁多。一些多糖如果膠、卡拉膠能夠吸附在球狀蛋白質表面形成一層“保護膜”，通過搭建靜電屏障來提高蛋白的熱穩(wěn)定性[3]；生物類表面活性劑鼠李糖脂[4]和海藻糖脂[5]可以提高蛋白質的熱解折疊溫度，并且隨添加量的增加，蛋白質熱解折疊溫度進一步提高，但研究對象均以牛血清白蛋白(BSA)為模型。Takai等[6]證明精氨酸可以顯著提高豬肉肌球蛋白在生理鹽溶液中的溶解度而不影響其二級結構；Gao等[7]向0.1 mol/L NaCl中添加5 mmol/L 組氨酸后，鯉魚肌球蛋白溶解度明顯增加，形態(tài)學結果觀察到在熱處理過程中組氨酸誘導肌球蛋白形成了更細的聚集體和蜂窩狀網(wǎng)絡；但時嬌嬌[8]51-52、石彤[9]的研究顯示精氨酸、組氨酸對低離子強度下魚肉肌球蛋白的熱聚集無明顯抑制效果。

相較于植物蛋白而言，水產(chǎn)蛋白熱穩(wěn)定性較差，而一些改善劑如果膠、卡拉膠等大分子多糖通常需要特定的pH和較高的溫度條件才能溶解，在改善魚肉蛋白熱穩(wěn)定性時受到了限制。硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)在室溫及中性條件即可溶解，更適合應用于食品體系。研究[10-11]證實DS可有效抑制蛋白質的熱聚集，但鮮見在魚肉蛋白中的應用。為此，本研究以肌球蛋白為模型，在低離子強度(1，50，150 mmol/L KCl)熱處理(40，50，60，70，80 ℃，1 ℃/min)條件下，探討DS對肌球蛋白熱變性聚集的抑制效果及作用機理，提高對帶電多糖—蛋白質相互作用的認識，為肌球蛋白的基礎研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

鮮活羅非魚：湛江市場(2018年3～6月)；

硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)：分析純，美國Sigma公司；

Lowry蛋白濃度測定試劑盒：上海荔達生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機：Avanti J-26sxp型，美國貝克曼公司；

恒溫水浴鍋：TU-20HT型，英國比比科技有限公司；

圓二色譜儀：Chirascan V100型，英國應用光物理公司；

納米粒度分析儀：Nano-2s MPT-2型，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌球蛋白的提取 根據(jù)洪偉[12]的方法，所用溶液均提前預冷至4 ℃。

1.3.2 樣液的制備 用Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，1，50，150 mmol/L KCl，pH 7.0)對肌球蛋白透析24 h。Lowry法[13]測定蛋白濃度，用對應的Tris-HCl緩沖液稀釋至2.0 mg/mL。

將肌球蛋白溶液分為兩組：① 未添加組；② 添加組：向不同離子強度(1，50，150 mmol/L KCl)下肌球蛋白溶液中加入0.4 mg/mL的硫酸葡聚糖。

1.3.3 程序升溫處理 運行程序控溫熱處理軟件，設置升溫速率為1 ℃/min。用溫度計測量樣液溫度為40，50，60，70，80 ℃時[14]取出備用。對照組溫度為4 ℃。

1.3.4 濁度的測定 稀釋蛋白濃度至0.5 mg/mL，在350 nm 處測吸光度[14]。

1.3.5 溶解度的測定 參照文獻[13]。溶解度按式(1)計算：

(1)

式中：

c——溶解度，%；

m1——上清液中可溶性蛋白濃度，mg/mL；

m2——離心前蛋白濃度，mg/mL。

1.3.6 二級結構α-螺旋含量分析 蛋白濃度稀釋為0.1 mg/mL，設置掃描范圍為190～260 nm。樣品池光徑為1 mm，對照組測量溫度為4 ℃。使用儀器控溫程序進行熱處理，升溫速率為1 ℃/min，在40，50，60，70，80 ℃時測試。根據(jù)Ogawa等[15]的方法計算α-螺旋含量。

1.3.7 表面電勢的測定 固定蛋白濃度1 mg/mL，設置He-Ne激光為633 nm、散射角為90°[16]對樣品進行除塵。使用Smoluchowski方程計算電勢值。

1.3.8 透射電鏡分析 固定蛋白濃度0.25 mg/mL滴于150目銅網(wǎng)，超純水多次沖洗后用0.5%～1.0%的醋酸雙氧鈾負染[17]并放入烘干箱(37 ℃)烘干。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0軟件對文中各數(shù)據(jù)作圖，用SPSS 19.0比較分析差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 硫酸葡聚糖對肌球蛋白濁度的影響

固定肌球蛋白2.0 mg/mL，加入0.4 mg/mL硫酸葡聚糖(DS)后，用對應離子強度的Tris-HCl緩沖液稀釋至0.5 mg/mL，肌球蛋白體系濁度的變化如圖1所示，在低離子強度(1 mmol/L KCl)下，肌球蛋白呈不溶狀態(tài)[2]，蛋白溶液渾濁，可檢測的濁度值高，熱處理后肌球蛋白分子進一步聚集，體系濁度明顯增大(P<0.05)。加入DS后，DS完全溶解，體系濁度值明顯減小(P<0.05)，熱處理過程中濁度變化不明顯，與對照組比較，濁度明顯降低(P<0.05)，表明DS能明顯抑制低離子強度下肌球蛋白的熱聚集[圖1(a)]。

隨著離子強度增加，分子間靜電相互作用增加，肌球蛋白纖絲狀聚集體逐漸解聚[8]12-13，體系濁度逐漸減小。在生理離子強度(150 mmol/L KCl)下，溶液中鹽離子所產(chǎn)生的反離子膠束作用[18]抑制了DS的溶解，肌球蛋白體系濁度明顯增大(P<0.05)，但與未添加DS的肌球蛋白比較，熱處理后體系濁度明顯降低(P<0.05)[圖1(c)]，肌球蛋白體系熱聚集情況有所改善。

2.2 硫酸葡聚糖對肌球蛋白溶解度的影響

如圖2所示，低離子強度(1 mmol/L KCl)下肌球蛋白的溶解度僅為25%，熱處理后溶解度明顯下降(P>0.05)，當溫度為40 ℃時，肌球蛋白溶解度下降到約8%；添加DS后，肌球蛋白溶解度降低(P<0.05)，表明未經(jīng)熱處理時DS對低離子強度下肌球蛋白無增溶效果，可能是肌球蛋白和DS均屬于大分子產(chǎn)生了相分離現(xiàn)象[19]，DS此時無法與肌球蛋白完全結合。但在熱處理過程中含有DS的肌球蛋白溶解度變化不明顯，當溫度達到50 ℃時，其溶解度仍高于30%，表明DS能明顯抑制低離子強度下肌球蛋白的熱聚集。

隨著離子強度的升高，肌球蛋白溶解度隨之升高，這是因為鹽離子可誘導肌球蛋白纖絲解聚，分子以單體或可溶性寡聚體形式存在[20]。因此，在生理離子強度(150 mmol/L KCl)下可達84%。添加DS后，50 mmol/L KCl溶液中肌球

不同大寫字母表示同一溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一樣品之間差異顯著(P<0.05)

蛋白溶解度降低(P<0.05)，生理離子強度(150 mmol/L KCl)下無明顯變化(P>0.05)。但與未添加DS的肌球蛋白體系比較，添加DS后進一步熱處理過程中肌球蛋白溶解度增加(P<0.05)，表明DS能部分抑制肌球蛋白的熱聚集。

2.3 硫酸葡聚糖對肌球蛋白電勢的影響

為了進一步探討DS對肌球蛋白熱聚集的抑制機理，對3種離子強度下肌球蛋白分子的表面電勢進行分析，結果見圖3。在試驗范圍內(pH 7.0)，肌球蛋白整體帶負電，隨著KCl濃度的升高，體系電勢逐漸減小，可能是鹽離子的增加對肌球蛋白分子表面擴散雙電層產(chǎn)生了壓縮作用[21]，使肌球蛋白溶解度增加。經(jīng)過熱處理后，在1，50 mmol/L KCl條件下，隨著熱處理溫度的進行(40～70 ℃)，肌球蛋白體系電勢逐漸減小，質點間相互排斥作用減小，分散體系被破壞，分子間吸引力大于排斥力，發(fā)生聚集[22]。具體表現(xiàn)為懸浮液渾濁、顆粒粒徑增大，溶液中可溶性蛋白含量明顯下降。在150 mmol/L KCl下，鹽離子改變了帶電顆粒周圍的離子分布[23]，隨溫度升高表面電勢有升高的趨勢。添加負電性多糖DS后，試驗范圍內肌球蛋白體系電勢均明顯增加(P<0.05)，在1 mmol/L KCl條件下最為明顯，與對照組相比體系電勢增加了約25 mV，表明DS與肌球蛋白分子形成了穩(wěn)定的分散體[24]。與未添加DS的肌球蛋白體系比較，在1，50 mmol/L KCl條件下，熱處理初期肌球蛋白分子受熱部分展開，肌球蛋白表面帶正電荷的—NH3+通過靜電相互作用與DS上帶負電的—OSO3-結合形成復合物[25]，這種吸引作用比—NH3+與—CO2-的吸引作用要強烈，使得同溫度下肌球蛋白電勢明顯增大(P<0.05)，分子間排斥力大于吸引力，蛋白溶解度增加；當溫度升高到60～80 ℃時，肌球蛋白表面電勢依然較高，溶解度無明顯變化，說明DS-肌球蛋白形成的復合物熱穩(wěn)定性較好。而在生理離子強度下，在50～80 ℃ 溫度區(qū)間內，DS對肌球蛋白電勢無明顯影響，可能與鹽離子的干擾作用抑制了DS的作用效果有關。因此，低離子強度下DS抑制肌球蛋白熱聚集的效果可能與分子間強的靜電相互作用有關。

不同大寫字母表示同一溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一樣品之間差異顯著(P<0.05)

不同大寫字母表示同一溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4 硫酸葡聚糖對肌球蛋白α-螺旋含量的影響

3種離子強度下肌球蛋白分子二級結構的變化見圖4、5。KCl濃度為1 mmol/L時，溶解性差，α-螺旋含量僅有45%。隨著KCl濃度增大，肌球蛋白表面電荷增加，氨基酸之間的靜電相互作用增強，溶解度增大，二級結構趨于穩(wěn)定，α-螺旋含量逐漸增大。KCl濃度為150 mmol/L時，α-螺旋含量達到61.65%。為了探討熱處理過程中肌球蛋白的構象變化，用CD光譜儀對其進行升溫處理，當溫度達到肌球蛋白的變性溫度(50 ℃左右)時，肌球蛋白α-螺旋含量顯著下降(P<0.05)，從CD圖譜中可以看出3個離子強度(1，50，150 mmol/L KCl)下肌球蛋白的特征峰已經(jīng)完全消失，說明肌球蛋白已經(jīng)變性。繼續(xù)升高溫度(60～80 ℃)，蛋白分子熱運動加劇，疏水基團逐漸暴露，蛋白質之間的非共價鍵引起無規(guī)則聚集[26]，溶解度逐漸下降，α-螺旋含量繼續(xù)降低。

圖4 硫酸葡聚糖對肌球蛋白CD譜圖的影響Figure 4 Effect of DS on the CD-spectra of myosin

據(jù)Ru等[25]報道，多肽鏈上羰基(—CO)和氨基(—NH)之間的氫鍵維持了蛋白質的α-螺旋結構。經(jīng)DS處理后，與未添加組相比，在KCl濃度為1～50 mmol/L的蛋白體系中，α-螺旋含量明顯增大(P<0.05)，可能是DS的高電荷密度對氫鍵有所影響[27]。熱處理后，即使在80 ℃，肌球蛋白的α-螺旋含量依然有20%。在CD圖譜中觀察到肌球蛋白208 nm處的肩峰完好，222 nm處的肩峰消失。在KCl濃度為150 mmol/L的蛋白體系中，α-螺旋含量隨溫度升高呈下降趨勢；但是CD圖譜顯示在50 ℃時肌球蛋白的特征峰依然完整。雖然不同體系中DS對肌球蛋白構象的影響有所差異，但是足以說明在熱處理過程中，DS可以保護肌球蛋白的部分二級結構。

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2.5 硫酸葡聚糖對肌球蛋白分子形態(tài)變化的影響

利用透射電子顯微鏡觀察肌球蛋白分子形態(tài)的變化見圖6。在低離子強度(1 mmol/L KCl)下，肌球蛋白呈細絲狀，分子互相交聯(lián)纏繞，50 ℃熱處理后肌球蛋白絲狀體斷裂、減少，分子頭部聚集變大、尾部相互纏繞形成明顯的聚集體；添加DS后，肌球蛋白纖絲部分解聚，體系有分散的趨勢，50 ℃熱處理后纖絲聚集形成網(wǎng)絡結構，部分絲狀體聚集，與未添加DS的熱處理組比較，肌球蛋白的頭部和尾部未發(fā)生明顯大的聚集體，結合溶解度、電勢和分子二級結構的變化分析，DS誘導肌球蛋白蛋白分子靜電相互作用的變化導致了熱處理過程中網(wǎng)絡結構的形成，由此抑制了蛋白質大分子間的熱聚集。

在50 mmol/L KCl條件下，體系中鹽離子的存在促進肌球蛋白溶解，肌球蛋白絲狀體變粗、解聚。隨著鹽離子的繼續(xù)增加(150 mmol/L KCl)，肌球蛋白解離，以單體或二聚體形式均勻分散；經(jīng)過50 ℃熱處理后肌球蛋白絲狀體消失，頭部出現(xiàn)明顯聚集，尾部變短變粗，形成明顯的聚集體；添加DS后，蛋白質粗絲發(fā)生解離，整體上看，肌球蛋白體系逐步分散。進一步熱處理后，僅生理離子強度下的肌球蛋白形成了帶球狀顆粒的棒狀膠束，可能是溶液中與DS有強結合作用的反離子[18]較多，誘導了膠束的形成，體系有類似弱凝膠的狀態(tài)。

3 結論

硫酸葡聚糖是水溶性陰離子多糖，在低離子強度下，DS的高電荷密度可以使肌球蛋白體系電勢升高，肌球蛋白纖絲部分解聚，體系分散，熱處理后蛋白質分子部分伸展，DS的—OSO3-基團與暴露在肌球蛋白表面—NH3+基團產(chǎn)生強烈的靜電相互作用，形成了穩(wěn)定的復合物，保護了肌球蛋白分子的二級結構，分子形成網(wǎng)絡結構，部分絲狀體聚集；生理離子強度下，由于DS與鹽離子形成的反離子的膠束作用使肌球蛋白形成膠束，但是與未添加DS的肌球蛋白體系相比，溶解度依然較高。綜上表明DS可有效抑制低離子強度下肌球蛋白分子的熱聚集?；贒S與肌球蛋白的作用機理可為抑制肌球蛋白熱變性聚集提供一條新的解決思路。但DS與肌球蛋白作用過程中是否會引起多糖及蛋白分子本身結構的變化尚不清楚，有待進一步研究。