基于生存分析的三疣梭子蟹無水?；罴夹g(shù)研究

尚海濤，俞靜芬，朱 麟，崔 燕，林旭東，凌建剛

( 1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，浙江 寧波 315040；2.寧波市農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程重點實驗室，浙江 寧波 315040 )

梭子蟹(Portunus)(俗稱白蟹、槍蟹、飛蟹)是我國大型海洋經(jīng)濟(jì)蟹類，是沿海重要的漁業(yè)資源[1]。三疣梭子蟹(P.trituberculatus)肉質(zhì)細(xì)嫩、脂膏肥滿、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是海中珍品，可蒸、煎、炒，亦可蔥油、湯類，還可鮮食、腌食等。傳統(tǒng)的梭子蟹運輸方法有有水保活法(活水運輸)、冰鮮法(加冰運輸)、冷凍法等。無水保活，又稱離水?；睿蚍Q干法運輸，是對傳統(tǒng)運輸方法的一次革新，具有低成本、低污染、方便實用等優(yōu)點。研究較多的有鯽魚(Carassiusauratus)[2]、羅非魚(Oreochromissp.)[3]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[4]等魚類，還有日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[5]、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[6]等蝦類，及海灣扇貝(Argopectenirradians)[7]、厚殼貽貝(Mytiluscrassitesta)[8]等貝類?；罘椒ā?/p>

生存分析是將事件的結(jié)果(終點事件)和出現(xiàn)這一結(jié)果所經(jīng)歷的時間結(jié)合起來分析的一種統(tǒng)計分析方法。由于它考慮了每個觀測出現(xiàn)某一結(jié)局的時間長短，可以更好地描述終點事件發(fā)生規(guī)律。在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中具有廣泛而重要的應(yīng)用價值。近年來許多研究者更是將其應(yīng)用到生態(tài)學(xué)[9]、工程學(xué)[10]、社會學(xué)[11]、經(jīng)濟(jì)學(xué)[12]、計算機(jī)科學(xué)[13]等領(lǐng)域。

筆者將梭子蟹死亡作為終點事件，研究有水充氣、有水未充氣、高氧、高氧低二氧化碳等處理對三疣梭子蟹生存狀況的影響，應(yīng)用生存分析揭示三疣梭子蟹死亡規(guī)律，探析致死原因，以期為三疣梭子蟹的無水保活技術(shù)的應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

試驗用三疣梭子蟹購于寧波象山中國水產(chǎn)城。海水晶(上海保嘉工貿(mào)有限公司)；鈉石灰(上海納輝干燥試劑廠)；高純氧氣、氮氣、二氧化碳(寧波市方辛氣體公司)。

S-80B型增氧機(jī)(寧波橫溪賽爾電器廠)；LQP-B-4制冰機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；CheckPoint型O2/CO2氣體分析儀(丹麥PBI Dansensor公司)；FG4型便攜式溶解氧測定儀[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司]；MAP-H360型盒式包裝機(jī)(蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

試驗蟹為海捕野生三疣梭子蟹雄蟹，捆綁螯足，規(guī)格一致(150～200 g)，活潑健康。采用有水充氣的方法5 h內(nèi)運回寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室，再次挑選出活力強(qiáng)的蟹用于試驗。

1.2.2 離水干露試驗

將50只梭子蟹，隨機(jī)分成5組，每組10只，無水干露于塑料箱中，置于8～10 ℃冷庫中，每2 h觀察一次，評價梭子蟹活力，記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。

1.2.3 有水充氣試驗

將50只梭子蟹，隨機(jī)分成5組，每組10只，放置在8～10 ℃冷庫中的有水塑料箱中(按海水晶使用方法配制)，充氣增氧。每12 h觀察一次，評價梭子蟹活力，并記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。同時，測定水體溶解氧含量，并更換水體一次。

1.2.4 有水未充氣試驗

處理同1.2.3，但未充氣，放置在8～10 ℃冷庫中，每2 h觀察一次，評價梭子蟹活力，并記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。同時測定水體溶解氧含量。

1.2.5 加冰試驗

將50只梭子蟹，隨機(jī)分成5組，每組10只，無水狀態(tài)下置于塑料箱中，加入碎冰(蟹冰量約為1∶1.5)，放置在8～10 ℃冷庫中，每1 h觀察一次，評價梭子蟹活力，記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。

1.2.6 高氧試驗

將50只梭子蟹，以1層濕毛巾、2只蟹的方式置于包裝盒內(nèi)，采用盒式包裝機(jī)充入80%氧氣，自動熱壓封口。然后放置在8～10 ℃冷庫中，每8 h測定包裝盒內(nèi)氧氣和二氧化碳含量，拆封觀察一次，評價梭子蟹活力，并記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間，觀察后活蟹按拆口前測定的氧氣和二氧化碳含量再次充氣繼續(xù)試驗。

1.2.7 高氧低二氧化碳試驗

處理同1.2.6，只是預(yù)先在每個包裝盒內(nèi)放入20 g鈉石灰。

1.3 測試項目與方法

1.3.1 活力評價與死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)

5人評分小組按表1對梭子蟹活力進(jìn)行評價，并以0級活力作為蟹死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 溶解氧含量與氧氣/二氧化碳含量測定

采用溶解氧測定儀測定水體中溶解氧含量。采用氣體分析儀測定包裝盒內(nèi)的氧氣/二氧化碳含量。

1.4 統(tǒng)計方法

試驗結(jié)果采用SPSS 18.0軟件，進(jìn)行乘積極限法生存分析和Log-Rank檢驗，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹的生存曲線

捕撈后生存環(huán)境的變化使梭子蟹陸續(xù)死亡，其生存曲線見圖1。生存分析結(jié)果表明，不同?；钐幚黹g平均生存時間存著顯著性差異(P<0.05)(表2)。各處理下梭子蟹平均生存時間由長到短依次為有水充氣?；?68.4 h)>高氧低二氧化碳?；?53.1 h)>高氧?；?38.4 h)>離水干露(7.6 h)>有水未充氣?；?2.6 h)>加冰保活(1.8 h)。

圖1 不同處理下三疣梭子蟹的生存曲線

活力值操作方法表現(xiàn)死亡與否4～53～42～32～31～20～10抓起梭子蟹如抓起梭子蟹未見蟹足明顯伸縮輕掀蟹臍蟹足伸縮有力，頻率高蟹足伸縮有力，頻率中蟹足伸縮無力，頻率低蟹足伸縮有力，頻率高蟹足伸縮有力，頻率中蟹足伸縮無力，頻率低仍未見蟹足明顯伸縮活蟹死蟹

表2 不同處理下三疣梭子蟹生存表的平均生存時間

注：不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著，差異顯著性水平為0.05.

加冰是目前市場上常用的梭子蟹運輸方法之一，但由圖1可見，其死亡速度最快，表明加冰運輸“只保鮮不?；睢?。這一點主要與溫度低有關(guān)。謝佳彥等[14]研究表明，梭子蟹較適宜于5 ℃干法運輸。林國雄等[15]認(rèn)為，溫度過低、溫差太大，蟹體適應(yīng)不了突然的環(huán)境而產(chǎn)生嚴(yán)重斷足，甚至死亡，降低成活率，建議采用梯度降溫冷卻麻醉處理。

2.2 有水充氣和有水未充氣?；?/h3>

死亡是一個終點事件，只表示活力為0時的生存狀態(tài)。而活力是一個過程變量，可以更好的動態(tài)描述梭子蟹生存狀況和分析致死原因。有水充氣?；詈陀兴闯錃獗；钏笞有坊盍ψ兓喜町惥薮?，前者活力保持較好，后者卻極差。有水充氣?；羁梢猿掷m(xù)保持著高活力，而有水未充氣?；罨盍囊婚_始就急速下降，其下降起始時間早于平均生存時間2.6 h(圖2)，說明梭子蟹活力下降繼而死亡。有水充氣?；顓s未發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，未出現(xiàn)普遍活力快速下降的現(xiàn)象。

圖2 有水保活過程中三疣梭子蟹活力變化

有水?；钍悄壳笆袌錾献畛Ｓ玫乃笞有繁；罘绞?，但有水?；畋仨毘錃?，以提供充足的溶解氧。劉重斌等[16]研究認(rèn)為三疣梭子蟹有水保活生存關(guān)鍵的溶解氧水平為2～4 mg/L。0、10、20 ℃的水中飽和溶解氧分別為14.64、11.26、9.08 mg/L，實際天然水中氧氣含量達(dá)不到上述飽和量。有水未充氣起始點溶解氧僅8 mg/L。隨著梭子蟹呼吸消耗氧氣，溶解氧會迅速下降。有水充氣保活溶解氧含量一直保持在9～11 mg/L(圖3)，充足的氧氣避免了低氧脅迫和活力下降?？梢姡芙庋踉谟兴；钪衅鹬陵P(guān)重要的作用。

圖3 有水保活過程中水體溶解氧含量的變化

2.3 離水干露

梭子蟹離水后前4 h活力變化較為平穩(wěn)，僅略微下降，類似于有水充氣?；睿? h后，活力快速下降，活力變化又類似于有水未充氣?；睢ｋx水干露平均生存時間7.6 h，活力下降之后陸續(xù)死亡(圖4)。

梭子蟹靠鰓呼吸，雖然空氣中的氧氣含量21%(合300 mg/L)，遠(yuǎn)高于水中的溶解氧含量，但梭子蟹無法直接利用空氣中的氧氣。氧氣必須先溶解于水中(或鰓體水中)，再由蟹鰓呼吸利用。離水后蟹鰓中仍保留一定的水分，一定時間內(nèi)仍可提供氧氣，確保梭子蟹呼吸順暢。但鰓體中水分與有水保活量上的巨大差異，使得有水?；羁諝?氧)溶于水中的效率遠(yuǎn)不及直接溶于鰓體水中，這或許可解釋為什么有水未充氣?；钚Ч患半x水干露。但隨著離水干露時間的延長，蟹鰓中的水分排出，以及黏液、有機(jī)物等的附著，致使鰓絲黏著，有效氧氣的交換面積下降，對氧氣的有效利用減少，逐漸窒息死亡。如同有水未充氣?；睿x水干露后期導(dǎo)致低氧脅迫阻礙機(jī)體代謝能力，呼吸受阻，最終窒息死亡[17]。

圖4 離水干露過程中三疣梭子蟹活力變化

2.4 高氧?；?/h3>

由圖1、表2可見，高氧?；钇骄鏁r間(38.4 h)顯著高于離水干露(7.6 h)，活力快速下降的起始點(16 h)也遠(yuǎn)晚于離水干露(4 h)，表明高含量氧氣有利于梭子蟹的?；?。這一點與何蓉等[18]的研究結(jié)果相一致，他們認(rèn)為充足的氧氣供應(yīng)是?；钸\輸?shù)那疤帷８哐跤欣诒３炙笞有份^高的活力和存活率，也從另一方面反映出梭子蟹離水后死亡與低氧脅迫有關(guān)。根據(jù)亨利定律高氧增加了氧分壓，意味著蟹鰓中可以溶解更多的氧氣。空氣中氧氣含量為21%，高氧?；顬?0%，如離水干露的梭子蟹鰓中溶解氧為8 mg/L，高氧環(huán)境理論上溶解氧應(yīng)為30 mg/L，很大程度上可抵消低氧脅迫。

但是高氧保活后期還是發(fā)生了活力快速下降和死亡的現(xiàn)象(圖5)。由包裝盒內(nèi)氣體成分分析可知(圖6)，隨著?；顣r間的延長，包裝盒內(nèi)的二氧化碳含量會持續(xù)上升。16 h后，二氧化碳含量達(dá)到3.5%時，活力開始快速下降。推測梭子蟹無水保活過程中不僅存在低氧脅迫，還存在高二氧化碳脅迫。

2.5 高氧低二氧化碳?；?/h3>

高氧低二氧化碳保活56 h后活力快速下降，比高氧?；钣盅娱L了40 h(圖7)。相對于平均生存時間53.1 h，也要晚2.9 h，表明死亡前未發(fā)生活力普遍下降的現(xiàn)象。其活力表現(xiàn)類似于有水充氣保活，而不同于離水干露、有水未充氣保活和高氧?；?。相對于高氧?；?，高氧低二氧化碳?；钸^程中CO2含量一直維持在極低的水平(圖8)，避免了高二氧化碳脅迫，提高了?；钚Ч?。

圖5 高氧保活過程中三疣梭子蟹活力變化

圖6 高氧?；钸^程中氧氣/二氧化碳含量變化

圖7 高氧低二氧化碳?；钸^程中三疣梭子蟹活力變化

圖8 高氧低二氧化碳?；钸^程中氧氣/二氧化碳含量變化

3 討 論

3.1 低氧脅迫致死

梭子蟹靠鰓呼吸，離水后鰓間仍保留一定的水分，短時間內(nèi)可提供充足的溶解氧供其正常呼吸，保持高活力和高存活率。但隨著離水時間的延長，一方面，伴隨著梭子蟹呼吸會不斷往體外排出水分，可利用的總?cè)芙庋鹾肯陆担硪环矫嬗捎陴ひ汉陀袡C(jī)物附著鰓絲致使有效氧交換面積下降，使梭子蟹呼吸窒息點逐漸上升而活力下降繼而死亡。這一現(xiàn)象被稱為低氧脅迫、或低氧窒息、或干露脅迫等。而低氧脅迫會導(dǎo)致內(nèi)臟損傷，如程民杰等[19]研究表明離水操作可能損傷了紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)的肝臟和腎臟，打破了體內(nèi)的平衡機(jī)制，代謝紊亂。姜娜等[17]發(fā)現(xiàn)，干露脅迫導(dǎo)致三疣梭子蟹肝胰腺總抗氧化能力水平顯著下降。高氧?；羁梢匝娱L梭子蟹無水保活時間，主要是通過提高梭子蟹鰓中溶解氧含量，抵消離水干露窒息點上升而產(chǎn)生的低氧脅迫，以達(dá)到?；畹男Ч?/p>

3.2 高二氧化碳脅迫致死

高氧環(huán)境采用的密封包裝下還存在高二氧化碳脅迫，高含量二氧化碳加速梭子蟹活力下降繼而死亡。這一研究發(fā)現(xiàn)與King等[20]的有水?；钛芯拷Y(jié)果相類似，他們認(rèn)為魚在有水?；钸\輸中，需要特別關(guān)注二氧化碳含量，高于80 mg/L就會導(dǎo)致高碳酸血癥，呼吸障礙，昏迷，最終死亡。正常代謝活動所允許的最高二氧化碳含量為20～30 mg/L。高二氧化碳含量時，不論含氧量是否充足，魚體基本上仍處于昏迷死亡狀態(tài)[21]。目前還未見梭子蟹無水狀態(tài)二氧化碳脅迫閾值的報道。當(dāng)水面二氧化碳分壓力為0.098 MPa時，0、10、20 ℃的水中二氧化碳飽和溶解量分別為3350、2310、1690 mg/L，由于空氣中二氧化碳含量僅約0.03% (260 mg/L)，與大氣二氧化碳相平衡，10 ℃時，水中二氧化碳僅為0.693 mg/L(2310×0.03%)。以80 mg/L計算，對應(yīng)的空氣中的二氧化碳含量為3.5%(80/2310)，而此含量時高氧保活梭子蟹活力開始快速下降，繼而死亡(圖6)。采用高氧低二氧化碳?；畋苊饬说脱鹾透叨趸济{迫，是一種有效的無水?；罘椒?。

低二氧化碳含量對梭子蟹活力無影響，超過傷害閾值的高二氧化碳含量會致死。而介于兩者之間的二氧化碳含量使梭子蟹休眠。目前有關(guān)魚類二氧化碳麻醉休眠正是利用這一特性，如二氧化碳麻醉休眠羅非魚[22]、鯽魚[23]、白斑狗魚[24](Esoxlucius)等，可以延長?；顣r間。

3.3 其他致死因素

適宜低溫有利于梭子蟹無水?；睿^低溫度或溫度驟降(如加冰)會產(chǎn)生低溫脅迫導(dǎo)致梭子蟹死亡。這一結(jié)果與彭婷等[25]認(rèn)為低溫脅迫致羅非魚昏迷及死亡的結(jié)果相類似。梭子蟹在低氧、高二氧化碳、低溫脅迫下死亡，其致死前活力普遍下降。而有水充氣?；詈透哐醯投趸急；?，避免了脅迫因素，?；顣r間相對較長，但仍然有限。隨著時間延長仍然會陸續(xù)死亡，其平均生存時間在活力快速下降之前，甚至不會出現(xiàn)活力快速下降的現(xiàn)象。因此，可推測梭子蟹還存在著其他致死因素，有待進(jìn)一步研究。

[1] 董志國, 李曉英, 閻斌倫, 等. 中國海五種群三疣梭子蟹的形態(tài)差異分析[J]. 海洋通報, 2010, 29(4):421-426.

[2] 曾鵬, 陳天及, 申江. 鯽魚冰溫離水?；罴鞍被岱治鯷J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 42(2):108-113.

[3] 范興, 陸玉芹, 陳名帥, 等. 三卡因甲磺酸鹽麻醉對羅非魚離水保活的影響[J]. 食品科技, 2014, 39(9):174-179.

[4] 聶小寶, 劉淇, 張長峰, 等. 泥鰍低溫?zé)o水?；罴夹g(shù)研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013(5):80-83.

[5] 齊靜濤. 日本對蝦活體干法運輸技術(shù)研究[J]. 齊魯漁業(yè), 1996, 13(5):47-48.

[6] 任紅梅, 萬玉芳, 李雪梅. 青蝦無水低溫保活運輸初探[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚, 2015, 31(5):50-51.

[7] 申淑琦, 萬玉美, 申亮, 等. 溫度、濕度和氧氣對海灣扇貝無水?；畹挠绊慬J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報, 2014, 29(5):492-497.

[8] 曹井志, 徐若, 包建強(qiáng). 厚殼貽貝低溫?zé)o水?；罴夹g(shù)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(10):4248-4249.

[9] 黃云鵬, 蘇松錦, 范繁榮, 等. 藍(lán)果樹種群徑級結(jié)構(gòu)與生命表分析[J]. 林業(yè)資源管理，2015(3):85-88.

[10] 王輝, 富宇平. 基于兩種生存分析方法的部件可靠性研究[J]. 航空維修與工程, 2014(6):82-85.

[11] 葉初升, 趙銳. 中國農(nóng)村的動態(tài)貧困:狀態(tài)轉(zhuǎn)化與持續(xù)——基于中國健康與營養(yǎng)調(diào)查微觀數(shù)據(jù)的生存分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:社會科學(xué)版, 2013(3):42-52.

[12] 賀筱君, 陳俊男, 吳佳懋. 生存分析在股市期市漲跌預(yù)測中的應(yīng)用[J]. 數(shù)量經(jīng)濟(jì)技術(shù)經(jīng)濟(jì)研究, 2014, (12):116-126.

[13] 劉江濤. 無線傳感器網(wǎng)絡(luò)的三層結(jié)構(gòu)生存分析[J]. 計算機(jī)與數(shù)字工程, 2015(9):1644-1646.

[14] 謝佳彥, 朱愛意. 幾種重要水產(chǎn)品活體運輸技術(shù)研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29(9):532-536.

[15] 林國雄, 李復(fù)雪. 三疣梭子蟹低溫?；畹某醪窖芯縖J]. 海洋漁業(yè), 1984(2):61-62.

[16] 劉重斌, 肖敏, 馮彥紅, 等. 水溶氧對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus，Miers，1876)生理應(yīng)答的影響[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報, 2011, 23(3):506-513.

[17] 姜娜, 王芳, 路允良, 等. 干露對三疣梭子蟹抗氧化和應(yīng)激能力的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2014, 38(12):1996-2004.

[18] 何蓉, 謝晶. 水產(chǎn)品?；罴夹g(shù)研究現(xiàn)狀和進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(5):243-246.

[19] 程民杰, 黃亞東, 徐文敏, 等. 離水操作脅迫對紅鰭東方鲀血清生化指標(biāo)的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(4):227-231.

[20] King H R, Jones B, Tensen M C. Fish transport in the aquaculture sector: an overview of the road transport of Atlantic salmon in Tasmania[J]. Journal of Veterinary Behavior Clinical Applications & Research, 2009, 4(4):163-168.

[21] 汪之和, 張飲江, 李勇軍. 水產(chǎn)品?；钸\輸技術(shù)[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化, 2001, 28(2):31-34.

[22] 周翠平, 白洋, 秦小明, 等. 二氧化碳麻醉技術(shù)在羅非魚無水?；钸\輸中的應(yīng)用研究[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化, 2014, 41(4):21-25.

[23] 張恒, 汪玉祥, 冒森莉, 等. 淡水魚碳酸休眠法無水?；钸\輸技術(shù)[J]. 水產(chǎn)科技情報, 2008, 35(5):236-240.

[24] 金一春, 胡萍華, 曲學(xué)偉, 等. 二氧化碳麻醉對白斑狗魚的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009(12):138-140.

[25] 彭婷, 胡庭俊, 林勇, 等. 低溫脅迫對羅非魚血液生化、免疫及抗氧化指標(biāo)的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2012, 31(5):259-263.