低溫脅迫對(duì)煙苗葉形及生理特性的影響

李琦瑤，王樹聲，周培祿，劉光亮，曾文龍，周道金，鄭 璇，陳愛國(guó)*

煙草移栽后因倒春寒帶來的低溫冷害問題在我國(guó)南方煙區(qū)普遍存在。低溫致使煙苗生長(zhǎng)緩慢或受阻，造成煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1]。前人研究表明，煙草生長(zhǎng)的最適溫度為25～28 ℃，1～2 ℃低溫可使幼苗死亡[2]。煙草需達(dá)到一定苗齡才能具備感受低溫的能力，從而引起相關(guān)生理響應(yīng)。韓錦峰等[3]通過低溫誘導(dǎo)頂芽發(fā)育及激素含量發(fā)現(xiàn)，煙草 K326在6片真葉之前對(duì)低溫不敏感，7葉期才是煙草感受低溫最敏感的時(shí)期。當(dāng)前，低溫對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響以早花為主[4]，而針對(duì)我國(guó)南方煙區(qū)出現(xiàn)的因低溫冷害帶來的上部葉開片差問題的研究卻未見報(bào)道。葉形變化是由量變到質(zhì)變逐漸發(fā)展的過程，低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，葉形受到的抑制作用越明顯[5]。研究證實(shí)，低溫對(duì)其影響主要體現(xiàn)在葉片基-頂軸和中-側(cè)軸兩個(gè)軸向生長(zhǎng)共同決定的葉片長(zhǎng)寬比上[6]。

本試驗(yàn)選用對(duì)低溫敏感且在我國(guó)廣泛種植的烤煙品種K326為材料[7-8]，利用人工智能氣候箱對(duì)煙草苗期進(jìn)行低溫脅迫處理，通過對(duì)相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定，探討低溫脅迫后的生理特性與恢復(fù)生長(zhǎng)后葉片長(zhǎng)寬比的關(guān)系，為揭示低溫脅迫下煙苗葉形變化的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年1—8月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。供試品種烤煙K326由國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)煙草種質(zhì)資源子平臺(tái)（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所）提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將25 ℃下長(zhǎng)至7葉齡的煙苗置于人工智能氣候箱內(nèi)進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理。前期預(yù)試驗(yàn)證明，4 ℃低溫脅迫48 h后常溫下難以恢復(fù)生長(zhǎng)，故確定該脅迫溫度的臨界時(shí)長(zhǎng)為48 h。以常溫（25 ℃）生長(zhǎng)的煙苗為對(duì)照，設(shè)置低溫（4 ℃）脅迫3、6、12、24和48 h為處理，處理后分別置于25 ℃下恢復(fù)生長(zhǎng)。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定 低溫脅迫結(jié)束時(shí)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取3株煙苗的自下而上第4葉位葉片，混合，進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。測(cè)定方法如下：

電導(dǎo)率的測(cè)定采用真空抽氣法；丙二醛（MDA）含量的測(cè)定采用2-硫代巴比妥酸顯色法；可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法；脯氨酸含量的測(cè)定采用磺基水楊酸提取法；葉綠素含量的測(cè)定采用80%丙酮提取液浸提法；超氧物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法；過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法；過氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用比色法。以上方法參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 低溫后恢復(fù)生長(zhǎng)煙苗葉形測(cè)量 選擇常溫對(duì)照、低溫脅迫3、6、12、24和48 h后恢復(fù)生長(zhǎng)的煙苗，每隔2天用卷尺人工測(cè)量自下而上第4葉位葉片的葉長(zhǎng)、葉寬，計(jì)算長(zhǎng)寬比（葉長(zhǎng)/葉寬），每處理重復(fù)測(cè)量 3株。測(cè)量方法參考 YC/T 142—2010煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2007和SAS 9.4對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)分析及圖形制作。

2 結(jié) 果

2.1 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)煙苗生理特性的影響

2.1.1 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)煙苗細(xì)胞膜系統(tǒng)的影響 圖1-A示出，常溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)電導(dǎo)率變化不大，而低溫生長(zhǎng)的煙苗相對(duì)電導(dǎo)率隨脅迫時(shí)間的增加不斷升高。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加 39.7%、51.3%、83.1%、87.0%、112.1%，均達(dá)顯著性差異水平（p＜0.05）。圖1-B示出，常溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)MDA含量變化不大，而低溫生長(zhǎng)的煙苗MDA含量隨低溫脅迫時(shí)間的增加先升高后降低。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加 80.5%、136.3%、67.6%、67.2%、31.7%。

2.1.2 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)煙苗保護(hù)酶系統(tǒng)的影響 圖2-A所示，常溫和低溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)SOD活性變化不大。除低溫脅迫12 h外，低溫脅迫3、6、24、48 h較脅迫前分別增加18.2%、16.8%、28.7%、28.4%。圖2-B所示，常溫和低溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)POD活性變化也不明顯。低溫脅迫3、6 h較脅迫前分別降低13.2%、2.6%；低溫脅迫12、24 h分別增加13.1%、3.6%；低溫脅迫48 h降低11.6 %。圖2-C所示，常溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)CAT活性變化不大，而低溫生長(zhǎng)的煙苗CAT活性隨脅迫時(shí)間的增加不斷降低。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別降低23.3 %、35.2 %、38.4 %、35.4 %、54.1%，均達(dá)顯著性差異水平（p＜0.05）。

圖1 低溫脅迫對(duì)煙草苗期相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響Fig. 1 Effect of low temperature stress on relative conductivity and the content of malonaldehyde in tobacco seedlings

圖2 低溫脅迫對(duì)煙草苗期SOD、POD和CAT活性的影響Fig. 2 Effect of low temperature stress on SOD activity, POD activity and CAT activity in tobacco seedlings

2.1.3 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)煙苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 圖3-A所示，常溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)脯氨酸含量變化不大，而低溫生長(zhǎng)的煙苗隨脅迫時(shí)間的增加不斷升高。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加 53.5%、101.1%、223.7%、254.5%、320.0 %，均達(dá)顯著性差異水平（p＜0.05）。圖 3-B所示，常溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)可溶性糖含量變化不大，而低溫生長(zhǎng)的煙苗隨脅迫時(shí)間的增加不斷升高。低溫脅迫 3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加118.0%、220.4%、286.7%、421.7%、436.1%，均達(dá)顯著水平（p＜0.05）。

2.1.4 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)煙苗葉綠素含量的影響 圖4示出，常溫生長(zhǎng)的煙苗48 h內(nèi)葉綠素含量變化不大，而低溫生長(zhǎng)的煙苗隨脅迫時(shí)間的增加先升高后降低。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加15.9%、20.5 %、39.4%、65.2%、37.9%，均達(dá)顯著性差異水平（p＜0.05）。除脅迫前，同一時(shí)間不同溫度條件下的葉綠素含量也均達(dá)顯著性差異水平（p＜0.05）。

圖3 低溫脅迫對(duì)煙草苗期脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effects of low temperature stress on the content of proline and the content of soluble sugar in tobacco seedlings

圖4 低溫脅迫對(duì)煙草苗期葉綠素含量的影響Fig. 4 Effects of low temperature stress on the content of chlorophyll in tobacco seedlings

2.2 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)煙苗葉形指標(biāo)的影響

由表1可知，低溫處理前各處理煙苗葉形指標(biāo)大致相同。低溫脅迫48 h內(nèi)煙苗均能恢復(fù)生長(zhǎng)，但不同低溫脅迫時(shí)間處理后煙苗葉長(zhǎng)、葉寬和葉面積的生長(zhǎng)速度及葉片長(zhǎng)寬比的變化趨勢(shì)較同期對(duì)照有所差異。低溫脅迫后恢復(fù)生長(zhǎng)第 16天，所有處理的煙苗葉片長(zhǎng)寬比趨于穩(wěn)定。進(jìn)一步對(duì)恢復(fù)生長(zhǎng)20 d后葉形指標(biāo)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，不同低溫脅迫時(shí)間處理的煙苗葉長(zhǎng)較同期對(duì)照無明顯差異，但葉寬、葉面積均顯著小于同期對(duì)照，說明4 ℃低溫脅迫3 h即可對(duì)恢復(fù)生長(zhǎng)后的葉面積造成不可逆的影響。葉片長(zhǎng)寬比方面，常溫生長(zhǎng)的煙苗葉片長(zhǎng)寬比未發(fā)生明顯變化，維持在1.764～1.787，而低溫處理后的煙苗均表現(xiàn)出長(zhǎng)寬比增大趨勢(shì)，整體來看，低溫脅迫時(shí)間對(duì)葉片長(zhǎng)寬比的影響程度為12 h＞24 h＞6 h＞3 h＞48 h，其中低溫脅迫12 h顯著大于同期對(duì)照（p＜0.05）。低溫脅迫3 h后葉片長(zhǎng)寬比峰值出現(xiàn)在恢復(fù)生長(zhǎng)后第10天，而低溫脅迫6、12、24和48 h的峰值均在第16天。

3 討 論

植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)是一種積極主動(dòng)的應(yīng)激過程[10-11]。大量研究表明[12-14]，細(xì)胞膜的損傷與自由基、活性氧引起的膜脂過氧化和蛋白質(zhì)活性降低甚至喪失有關(guān)[15]。本試驗(yàn)中，不同低溫脅迫時(shí)間處理的煙苗相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均顯著高于同期對(duì)照，其中MDA含量在低溫脅迫12 h后開始降低，其原因可能是煙苗在經(jīng)歷一定時(shí)間的冷馴化后，細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸和磷脂含量有所增加，細(xì)胞膜的流動(dòng)性增強(qiáng)，抗寒性得到提高[16-17]。SOD、POD和 CAT等抗氧化酶能清除體內(nèi)活性氧，是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的天然保護(hù)體系[18]。本試驗(yàn)中，不同低溫脅迫時(shí)間處理后SOD和POD活性變化不大。前人研究發(fā)現(xiàn)，POD在酶促保護(hù)系統(tǒng)中具有雙重性，可能參與活性氧的生成和葉綠素的降解，并可能引發(fā)膜脂過氧化作用，表現(xiàn)出一定的傷害效應(yīng)[19]。此外，低溫影響NADP+的供給過程，電子傳遞失衡導(dǎo)致活性氧含量增加也會(huì)影響SOD和POD的活性[20]。另有報(bào)道稱，生長(zhǎng)素的生物合成直接參與葉片形態(tài)決定[21]。研究發(fā)現(xiàn)[22]，擬南芥CAT2突變體中，生長(zhǎng)素的含量受到過氧化氫的調(diào)控，并且由過氧化氫調(diào)節(jié)導(dǎo)致的生長(zhǎng)素含量的降低是與植物偏下性生長(zhǎng)的葉片表型相連鎖的。本研究中，CAT活性隨低溫脅迫時(shí)間的增加不斷降低，與楊雪梅等[23]測(cè)定結(jié)果并不一致，其原因有待進(jìn)一步研究。

表1 低溫后恢復(fù)生長(zhǎng)階段煙苗的葉形變化Table 1 Change of leaf shape of tobacco seedlings in low temperature after resuming growth

低溫脅迫會(huì)使植物細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)積累大量統(tǒng)稱為滲透溶質(zhì)的小分子代謝物質(zhì)，包括氨基酸、糖以及季銨類化合物（如甜菜堿等）等，其含量的增加有助于細(xì)胞持水和生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[24]。本試驗(yàn)中，不同低溫脅迫處理的煙苗脯氨酸和可溶性糖含量均顯著高于同期對(duì)照，且均在低溫脅迫12 h時(shí)出現(xiàn)大幅增加，說明煙草K326在低溫脅迫12 h其耐冷性與脯氨酸和可溶性糖的積累有一定的相關(guān)性[25]。低溫會(huì)打破葉綠素原有的合成和降解平衡，從而導(dǎo)致葉綠素含量發(fā)生變化[26]。隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素含量先升高后降低，一方面可能是脅迫后期葉綠素合成酶活性降低，葉綠體合成受阻而造成，另一方面也可能是低溫引起了葉綠體功能的紊亂[27]，或加速了葉綠素的分解和葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)的受損使葉綠素含量降低[28]，同樣的研究結(jié)論在不同楊樹耐冷的生理研究中也得到驗(yàn)證[29]。

我國(guó)南方煙區(qū)因早春低溫冷害帶來的早花、上部葉開片差等問題嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[30]。本試驗(yàn)中，4 ℃低溫脅迫顯著抑制葉長(zhǎng)和葉寬的生長(zhǎng)，且對(duì)葉寬的抑制作用強(qiáng)于對(duì)葉長(zhǎng)的抑制作用，說明4 ℃低溫脅迫對(duì)葉片中-側(cè)軸的影響高于基-頂軸，葉寬生長(zhǎng)停滯的響應(yīng)要早于葉長(zhǎng)，從而增大葉片長(zhǎng)寬比，這與前人研究夜間低溫對(duì)紅花大金元、云煙87葉形的影響研究結(jié)果一致[7]。恢復(fù)生長(zhǎng)16 d后，不同處理的葉片長(zhǎng)寬比均達(dá)最高峰，此后趨于穩(wěn)定。分析恢復(fù)生長(zhǎng)20 d后各葉形指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫3 h處理就對(duì)恢復(fù)生長(zhǎng)后的煙苗葉面積造成不可逆的影響，且恢復(fù)生長(zhǎng)20 d后不同低溫脅迫時(shí)間處理煙苗的葉面積無明顯差異，而此時(shí)低溫脅迫12 h處理的煙苗葉片長(zhǎng)寬比顯著大于同期對(duì)照及其他低溫處理葉片長(zhǎng)寬比，進(jìn)一步說明12 h的低溫脅迫對(duì)葉片橫向生長(zhǎng)影響程度較大。

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

對(duì)于溫敏性較強(qiáng)的品種K326，在受到4 ℃低溫脅迫生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)在低溫時(shí)間48 h內(nèi)采取措施，避免葉形狹長(zhǎng)及葉片生長(zhǎng)延緩甚至停滯的現(xiàn)象。前人研究發(fā)現(xiàn)[7]，低溫對(duì)烤煙 K326苗期葉長(zhǎng)葉寬生長(zhǎng)存在累加效應(yīng)，夜間低溫處理時(shí)間越長(zhǎng)累加效應(yīng)越明顯，煙葉長(zhǎng)寬生長(zhǎng)停滯累加效應(yīng)葉寬效果要明顯于葉長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)葉片長(zhǎng)寬比增大的誘導(dǎo)程度為12 h＞24 h＞6 h＞3 h＞48 h，低溫脅迫12～24 h對(duì)葉形影響最大，但脅迫48 h后影響效果又有所減小，原因有待進(jìn)一步研究。此外，本研究選取的烤煙生長(zhǎng)階段為苗期，脅迫溫度為4 ℃，具有生長(zhǎng)階段針對(duì)性和溫度局限性，其他脅迫溫度或苗期以外的生長(zhǎng)時(shí)期能否得出相同的結(jié)論還有待進(jìn)一步試驗(yàn)和探索。

4 結(jié) 論

隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸含量和可溶性糖含量不斷升高；MDA含量和葉綠素含量先升高后降低；CAT活性不斷降低；SOD和 POD活性變化不大。4 ℃低溫脅迫抑制恢復(fù)生長(zhǎng)后葉片葉長(zhǎng)、葉寬和葉面積的生長(zhǎng)，對(duì)葉寬的抑制作用強(qiáng)于對(duì)葉長(zhǎng)的抑制作用，葉片長(zhǎng)寬比增大。不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)葉片長(zhǎng)寬比增大的誘導(dǎo)程度為 12 h＞24 h＞6 h＞3 h＞48 h。

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