煙草野火病菌特異性檢測引物篩選及應(yīng)用

陳瑞朋，盧 凱，張 敏，劉元德，宗 浩，牛紀(jì)軍，劉文濤，徐后娟*

煙草野火?。═obacco Wildfire）是由丁香假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas syringaepv.Tabaci）危害引起的一種煙草中后期葉部病害，在世界范圍內(nèi)廣泛分布。該病害在我國各主產(chǎn)煙區(qū)均有報(bào)道，近幾年在云南、山東等主要產(chǎn)煙區(qū)的發(fā)生危害普遍且呈上升趨勢，氣候適宜時(shí)極易造成大面積流行，從而影響到煙草的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)[1-2]。目前對于煙草野火病的檢測方法一般是基本對發(fā)病癥狀的觀察，此類方法必須是在發(fā)病之后，無法對病害進(jìn)行提前的預(yù)報(bào)[3-6]，且田間病害癥狀發(fā)病初期和其他幾種葉部病害相似，生產(chǎn)上容易導(dǎo)致誤診。利用分子生物學(xué)病害診斷法具有準(zhǔn)確、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物病害的診斷[7-9]。本研究利用Mauve軟件，對不同的假單胞菌屬以及丁香假單胞菌不同致病變種的全基因組進(jìn)行比對，找到了丁香假單胞菌煙草致病變種的特異性區(qū)段，并據(jù)此進(jìn)行了丁香假單胞菌煙草致病變種的檢測引物的篩選和應(yīng)用研究[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：煙草野火病標(biāo)準(zhǔn)菌株由牡丹江煙草研究所提供。其他煙草野火病菌分別采集于山東省諸城市、高密市、臨朐縣、沂水縣、蒙陰縣、沂南縣、日照嵐山以及貴州省、湖北省、福建省、云南省。供試對照菌株均為實(shí)驗(yàn)室保存，分別為蟲媒假單胞桿菌（P. entomophila）、類黃色假單胞桿菌（P.parafulva）、惡臭假單胞桿菌（P. putida）、嗜鹽假單胞桿菌（P. psychrotolerans）、熒光假單胞桿菌（P.fluorescens）、青枯假單胞桿菌（P. solanacearum）、巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽胞桿菌（B. subtilis）、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、鏈格孢菌（Alteraria alternata）、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、沙福芽孢桿菌（B. safensis）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）、歐文氏桿菌（Erwinia carotovora）；DNA聚合酶等購置于諾唯贊生物科技有限公司，引物由上海生工生物科技有限公司合成，PCR測序由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成，DL1000 maker購置于大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草野火病菌引物設(shè)計(jì) 從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中下載全基因組數(shù)據(jù)，包括假單胞菌屬 25個(gè)不同菌種以及127個(gè)丁香假單胞菌屬不同致病變種，利用軟件Mauve 2.3.1進(jìn)行全基因組比對，獲得特異性區(qū)段之后，利用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.2.2 細(xì)菌DNA的提取 DNA模板的簡易制備參照赫然等的煮沸法[11]?；蚪M DNA的提取使用CTAB 法[12]。

1.2.3 PCR鑒定引物特異性 首先將設(shè)計(jì)的13對引物與煙草野火病標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出能夠產(chǎn)生單一的目的大小條帶的引物，之后利用篩選出來的引物與對照菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察其能否與其他病原菌產(chǎn)生陽性反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性10 min； 94 ℃變性30 s，5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；PCR加樣體系如表1。

1.2.4 煙草感病葉片中野火病模板的制備 取大田中疑似感病的煙草葉片 10片，進(jìn)行表面消毒，將病斑以及病斑周圍1 cm以內(nèi)的葉片剪下，以病斑圓心為中心點(diǎn)，每3 mm將葉片切條，放于100 μL超純水中浸泡兩天兩夜。取50 μL浸泡液于金屬浴100 ℃加熱 10 min作為模板備用。感病葉片檢測PCR加樣體系如表2。

表1 PCR加樣體系Table 1 PCR system

表2 PCR加樣體系Table 2 PCR system

2 結(jié) 果

2.1 引物設(shè)計(jì)

利用軟件Mauve 2.3.1進(jìn)行全基因組比對，共找到P. syringae pv.tabaciATCC 11528的特異性序列段51個(gè)，進(jìn)一步利用Primer Premier 6.0對這些特異性序列段進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)引物13對，如表3所示。

2.2 引物篩選

將設(shè)計(jì)好的13對引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，模板為煙草野火病標(biāo)準(zhǔn)菌株，結(jié)果如圖1所示。其中引物5455、48016、40429、33239以及27344均能擴(kuò)增出目的大小條帶，測序驗(yàn)證為煙草野火病菌，其余8對引物擴(kuò)增條帶不理想，雜帶過多。

表3 煙草野火病菌引物Table 3 Primers of Pseudomonas syringae pv. Tabaci

圖1 煙草野火病菌引物篩選結(jié)果Fig. 1 Amplification results of P. syringae pv. Tabaci with different primers

2.3 引物的特異性篩選

將篩選出的5對引物分別與供試15種對照菌株進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，檢測初篩的5對引物的特異性。結(jié)果如圖2所示，引物5455、48016、33239、27344對于部分其他菌株能夠擴(kuò)增出條帶，引物40429對于15種相近其他病菌株均未擴(kuò)增出條帶。因此，確定引物40429為最佳煙草野火病菌的最佳引物。

圖2 不同引物對照菌種的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplification results of control bacteria with different primers

2.4 引物的特異性檢驗(yàn)

用實(shí)驗(yàn)室保存的來自 11個(gè)不同地區(qū)和標(biāo)準(zhǔn)的煙草野火病病菌，對引物 40429進(jìn)行特異性檢測。如圖3所示：引物40429均能夠?qū)τ趤碜圆煌貐^(qū)的煙草野火病擴(kuò)增出單一的目的條帶，條帶大小為203 bp，測序之后在NCBI進(jìn)行Blast比對顯示為煙草野火病菌，說明引物40429能夠?qū)煵菀盎鸩【M(jìn)行良好的特異性擴(kuò)增。

圖3 引物40 429對不同地區(qū)煙草野火病鑒定結(jié)果電泳圖Fig. 3 Amplification results of P. syringae pv. tabaci from different regions with primer pair 40 429

2.5 煙草野火病病菌最低檢測濃度的測定

用設(shè)計(jì)的最優(yōu)引物40 429對煙草野火病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，模板取1 μL。將煙草野火病菌分別稀釋為 1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10 cfu/mL 10個(gè)數(shù)量級梯度濃度。電泳結(jié)果如圖4所示：當(dāng)模板濃度降低到106cfu/mL時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物開始明顯降低，當(dāng)模板菌液濃度為104cfu/mL時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較少，但是仍然能夠檢測到，因此，最低檢測濃度為104cfu/mL。

圖4 不同模板濃度PCR電泳圖Fig. 4 Amplification results of different template concentrations

2.6 煙草感病葉片中野火病分子檢測

取上述制備的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)果如圖5所示，當(dāng)距離分別為3 mm和6 mm時(shí)候，進(jìn)行PCR反應(yīng)能夠產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，當(dāng)距離大于6 mm時(shí)，由于模板濃度過低未產(chǎn)生反應(yīng)。說明該引物能夠?qū)Υ筇镏懈胁〉臒煵萑~片能夠進(jìn)行較好的檢測。

圖5 煙草感病葉片PCR鑒定電泳圖Fig. 5 Amplification results with infected tobacco leaves

3 討 論

煙草野火病嚴(yán)重危害煙草葉片的完整度以及烤后煙葉的外觀質(zhì)量，給煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在實(shí)驗(yàn)室使用煙草野火病菌作為PCR反應(yīng)模板時(shí)，本試驗(yàn)最終獲得的分子檢測引物能夠?qū)煵菀盎鸩∵M(jìn)行精確的檢測，PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)，并且對于相近的其他雜菌不產(chǎn)生反應(yīng)。與前人設(shè)計(jì)的引物相比較，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物條帶大小較小，擴(kuò)增產(chǎn)物僅為203 bp，并且對于反應(yīng)體系的要求比較低，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)候能夠大大的縮短分子檢測所用時(shí)長，該引物設(shè)計(jì)時(shí)獲得的特異性區(qū)段，能為其他試驗(yàn)的引物設(shè)計(jì)提供思路。同時(shí)在對煙草表面的優(yōu)勢菌群進(jìn)行同步檢測時(shí)，未見擴(kuò)增出任何的條帶，所以本試驗(yàn)獲得的引物對于煙草野火病能夠較好地檢測。

在大田實(shí)際應(yīng)用中，試驗(yàn)獲得的引物能夠?qū)煵萑~片中的煙草野火病菌進(jìn)行直接檢測，但是檢測的條件比較嚴(yán)格，如果直接使用煙草病葉浸出液作為PCR擴(kuò)增模板，只有距離病斑部位很近時(shí)候才會(huì)產(chǎn)生目的條帶，這是由于煙草葉片病斑部位的病菌含量較低，本試驗(yàn)檢測到的病菌最低檢測濃度為104cfu/mL，只有當(dāng)病菌的濃度達(dá)到這個(gè)臨界值時(shí)，PCR才能夠進(jìn)行較好的擴(kuò)增并產(chǎn)生明顯的條帶。葉片中的病菌的數(shù)量由于達(dá)不到檢測的最低限度，需要較多的葉片累加進(jìn)行模板病菌的獲取才能夠進(jìn)行擴(kuò)增。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用Mauve 2.3.1和Primer Premier 6.0獲得了多對煙草野火病菌引物，通過PCR篩選驗(yàn)證得到1對煙草野火病菌特異性引物。利用煙草野火病菌和感病煙葉浸出液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到單一目的條帶，證明該引物對于煙草野火病菌能夠進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對煙草野火病菌進(jìn)行良好的檢測。

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