基于RAD-seq數(shù)據(jù)開發(fā)煙草多態(tài)性SSR標(biāo)記

李海洋，李榮華，夏巖石，袁清華，張振臣，趙偉才，郭培國*

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）又稱為微衛(wèi)星序列，是以1～6個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成的 DNA序列[1]，而基于其開發(fā)出的DNA分子標(biāo)記具有特異性強(qiáng)、共顯性、穩(wěn)定性高以及操作簡單等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到大豆、小麥、水稻等作物的遺傳研究[2-4]。雖然已有 SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草的遺傳圖譜構(gòu)建[5]、遺傳多樣性分析[6]、基因定位[7-8]等方面的研究報(bào)道，但與其他作物相比，煙草中可用的SSR標(biāo)記較少。

根據(jù) EST和基因組的 DNA序列挖掘和開發(fā)SSR標(biāo)記作為傳統(tǒng)方法，在其他植物中已經(jīng)有大量應(yīng)用[9-10]，在煙草中亦有報(bào)道。如根據(jù)野生絨毛狀煙草基因組的測序結(jié)果，分析了SSR位點(diǎn)的組成、分布及特征[11]；利用3種煙草基因組信息，對SSR位點(diǎn)的分布情況進(jìn)行探索，并設(shè)計(jì)出SSR引物組合[12]；根據(jù)煙草EST序列數(shù)據(jù)分析了EST-SSR位點(diǎn)信息及分布特征，并設(shè)計(jì)了一些SSR引物組合[13-15]。但由于常規(guī)栽培的普通煙草為異源四倍體，基因組較為復(fù)雜[16]，且我國的煙草品種還存在遺傳狹窄的問題[17]，開發(fā)出的SSR標(biāo)記多態(tài)性水平低[16,18-19]，制約了煙草SSR標(biāo)記的利用，導(dǎo)致SSR標(biāo)記在煙草中的研究和應(yīng)用相對較薄弱。

近年來，在第2代測序基礎(chǔ)上建立的簡化基因組測序技術(shù)，可利用酶切技術(shù)、序列捕獲芯片技術(shù)等其他手段降低物種基因組復(fù)雜程度，進(jìn)而了解物種部分基因組的特性。目前，主要應(yīng)用的簡化基因組測序技術(shù)包括復(fù)雜度降低的多態(tài)序列測序（complexity reduction of polymorphic sequences,CRoPS）[20]、基因分型測序技術(shù)（genotyping by sequencing, GBS）[21]、限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)的DNA測序（restriction-site associated DNA, RAD-seq）[22]。其中應(yīng)用較為廣泛的 RAD-seq是利用酶切技術(shù)降低基因組的復(fù)雜度，對酶切產(chǎn)生的RAD-tag進(jìn)行高通量測序，能夠開發(fā)大量的SNP和SSR標(biāo)記，而且具有成本低、準(zhǔn)確率高、不受參考基因組序列限制等優(yōu)點(diǎn)[23]。運(yùn)用該方法，已經(jīng)在茄子[24]、菠蘿[25]、花生[26]等其他植物上開發(fā)出 SSR標(biāo)記并應(yīng)用于遺傳分析。

本研究利用RAD-seq技術(shù)，對兩份煙草材料進(jìn)行簡化基因組測序，分析SSR位點(diǎn)的數(shù)量、重復(fù)序列次數(shù)、基序類型，大規(guī)模開發(fā)SSR分子標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)材料之間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，可降低具多態(tài)性SSR標(biāo)記引物篩選的工作量和成本，為多態(tài)性SSR標(biāo)記的篩選和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試4份煙草材料中“118-3”和“粵煙98”由廣東省煙草南雄科學(xué)研究所提供，“大葉密合”和“長脖黃”由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。其中用于簡化基因組測序的兩份煙草材料中，“118-3”為廣東省特色烤煙品種，“粵煙98”是趙偉才等[27]以“Coker206”為母本、“K326”為父本選育的烤煙新品種。另外兩份材料“大葉密合”和“長脖黃”分別為廣東省優(yōu)良的地方曬煙品種和河南省優(yōu)良地方烤煙品種。2016年3月采取4份煙草材料的新鮮葉片，利用李榮華等[28]改良的CTAB法提取4份煙草材料基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳和微孔板分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量。

1.2 簡化基因組測序

利用RAD-seq技術(shù)，對“118-3”和“粵煙98”兩份煙草材料的基因組DNA進(jìn)行簡化測序。操作流程簡述如下：選用六堿基限制性內(nèi)切酶 EcoR I酶切基因組DNA，構(gòu)建RAD文庫，利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測序；測序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、質(zhì)檢、評(píng)估等分析，獲得各個(gè)樣品的干凈讀長（clean reads）及序列數(shù)據(jù)。過濾參數(shù)如下：去除含adapter的reads，去除含N比例大于10%的reads，去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read的50%以上）。

1.3 基因組SSR位點(diǎn)的鑒別及SSR引物的設(shè)計(jì)

利用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）version 0.7.12軟件將過濾后得到的clean reads與參考烤煙基因組K326進(jìn)行比對，利用MISA（http∶//pgrc.ikpgatersleben.de/misa）軟件在read覆蓋的參考基因組序列中查找SSR位點(diǎn)。配置參數(shù)如下：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最低重復(fù)次數(shù)分別為15、6、5、4、4和4，相鄰 SSR序列間隔區(qū)域長度不小于100 bp。根據(jù)SSR位點(diǎn)兩翼的序列，利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)SSR引物。對兩份測序樣品中共有的 SSR位點(diǎn)進(jìn)行序列分析，若SSR位點(diǎn)在兩份測序材料之間存在重復(fù)差異即為多態(tài)性SSR。

1.4 PCR擴(kuò)增和檢測方法

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中包含30 ng/μL的DNA 模板 2 μL；10×PCR Buffer 1.2 μL，10 μmol/L的正反向引物各 0.2 μL；10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dd H20 6.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，適宜退火溫度45 s（退火溫度視引物的不同而改變），72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，按照郭培國等[29]改良的銀染技術(shù)進(jìn)行染色檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié) 果

2.1 煙草簡化基因組序列的產(chǎn)出和質(zhì)量檢測

煙草簡化基因組測序結(jié)果顯示，“118-3”和“粵煙98”兩個(gè)煙草樣品分別獲得45 120 744和50 362 336 clean reads，分別具有6.63 Gb和7.42 Gb的原始數(shù)據(jù)（表 1）。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、過濾，2個(gè)樣品共獲得95 480 084個(gè)高質(zhì)量干凈讀長（HQ clean reads），平均Q30（測序堿基質(zhì)量值，即測序時(shí)錯(cuò)誤識(shí)別的概率是0.1%、正確率為99.9%的堿基比例）為93.99%，平均GC含量為38.78%。從表1中可以看出，過濾前后差異很小，Q30處于較高水平，表明測序數(shù)據(jù)可靠；但GC含量處于較低水平，對本試驗(yàn)測序反應(yīng)影響不大。

表1 RAD-seq基因組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Summary of genomic sequences generated by RAD-seq

2.2 煙草簡化基因組中SSR位點(diǎn)的頻率和分布

運(yùn)用BWA軟件將“118-3”和“粵煙98”簡化測序獲得的clean reads與參考基因組進(jìn)行比對，分別比對上44 995 698和50 187 807個(gè)reads。在此基礎(chǔ)上，利用 MISA軟件在比對到參考基因組上的reads覆蓋區(qū)域中搜索SSR位點(diǎn)，在“118-3”和“粵煙98”中分別檢測到19 746和20 340個(gè)reads含有1個(gè)或以上的SSR位點(diǎn)，其中兩份材料中共有SSR位點(diǎn)的reads數(shù)為17 941個(gè)。兩份材料中共檢測到22 145個(gè)reads上含有25 343個(gè)SSR位點(diǎn)；這些含有SSR位點(diǎn)reads中，其中有17 882（80.74%）個(gè)reads含有1個(gè)SSR位點(diǎn)，剩余的reads含有2個(gè)或以上的SSR位點(diǎn)。

在所發(fā)現(xiàn)的SSR位點(diǎn)中，完全重復(fù)型（P型）所占的比例最大，共計(jì) 23 660個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的93.35%；復(fù)合型（C型）只有 1683個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的6.65%（表2）。P型SSR位點(diǎn)中，二核苷酸類型出現(xiàn)比例最高，達(dá) 10 513個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的41.48%；其次是三核苷酸，為 7631個(gè)（30.11%）；單核苷酸和四核苷酸的差別不大，分別為 2595（10.23%）和2108個(gè)（8.31%）；五核苷酸和六核苷酸最少，分別只有451（1.77%)和362個(gè)（1.42%）。從表2還可以看出，P型SSR位點(diǎn)中，以六核苷酸類型重復(fù)序列的平均長度最長，達(dá)到 26 bp；四核苷酸的平均長度最短，為17 bp；C型SSR位點(diǎn)的平均長度較長，為28 bp。

在P型SSR位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)298種基序，出現(xiàn)頻率最高的基序是AT/TA，為5337個(gè)位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的21.06%；隨后分別為T/A（2278個(gè)位點(diǎn)，8.99%）、AG/CT（1383個(gè)位點(diǎn)，5.46%）和TC/GA（1066個(gè)位點(diǎn)，4.21%）；此外TTG/CAA（816）、AAC/GTT（834）、AAG/CTT（461）、TTA/ATT（644）、TAT/ATA（539）、TTC/GAA（881）和AAAT/ATTT（805）基序達(dá)到總SSR位點(diǎn)數(shù)的1.5%以上（表2）。

表2 煙草基因組中的SSR位點(diǎn)的分布信息Table 2 Distribution of SSR loci in the tobacco genome

2.3 煙草基因組SSR位點(diǎn)基序重復(fù)次數(shù)

煙草不同類型SSR位點(diǎn)基序的重復(fù)次數(shù)如表3所示。從中可見，單核苷酸的基序重復(fù)次數(shù)集中在15～18次，二核苷酸和三核苷酸基序重復(fù)次數(shù)主要分布在6～9次和5～8次，四核苷酸在4～6次，而五和六核苷酸基序的重復(fù)次數(shù)主要集中在4～5次。從SSR位點(diǎn)基序重復(fù)次數(shù)來看，以6次基序重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)數(shù)最高，達(dá)到5171個(gè)SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)20.4%；5次和7次重復(fù)次數(shù)分別為3945和3141個(gè)SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)15.56%和12.39%。另外，從表3還可以看出，各個(gè)SSR位點(diǎn)類型出現(xiàn)的頻率均存在隨重復(fù)次數(shù)的增加而逐漸下降的趨勢。

2.4 煙草簡化基因組SSR引物設(shè)計(jì)與多態(tài)性驗(yàn)證

利用Primer 3.0軟件對25 343個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，成功設(shè)計(jì)出23 346對SSR引物，引物設(shè)計(jì)的成功率為 92.12%；根據(jù)“118-3”和“粵煙98”兩份材料的簡化測序數(shù)據(jù)，初步發(fā)現(xiàn)其中有323對引物的SSR位點(diǎn)在兩份材料間具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為1.38%。

隨機(jī)選擇50對具有多態(tài)性位點(diǎn)的SSR引物，利用兩份簡化測序煙草材料和另兩份煙草種質(zhì)材料對SSR位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證（圖1），SSR引物信息及驗(yàn)證結(jié)果如表4所示。從中可見50對引物在兩個(gè)簡化測序樣品中均能擴(kuò)出清晰的條帶，其中有 38對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，多態(tài)率達(dá)到76%；在另兩份種質(zhì)材料中有48對引物能擴(kuò)增出清晰條帶，有效擴(kuò)增率達(dá)96%，其中有10對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，多態(tài)率為20%。

表3 煙草基因組中SSR位點(diǎn)的基序重復(fù)次數(shù)分布Table 3 Distribution of repeat numbers of SSR motifs in tobacco genome

圖1 部分SSR引物在4份煙草材料中擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染圖Fig. 1 Image of silver staining for PCR amplicons of partial SSR primer pairs in four tobacco genotypes

表4 50對SSR引物在4份煙草材料中擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析Table 4 Polymorphic analysis for PCR amplicons of 50 SSR primer pairs in 4 tobacco genotypes

表4 （續(xù)）Table 4 (Continued)

3 討 論

3.1 煙草簡化基因組SSR位點(diǎn)分布特征

本研究在兩份煙草材料簡化基因組中共檢測到2種類型SSR位點(diǎn)：P型和C型。P型SSR位點(diǎn)中，二、三核苷酸類型出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)到SSR位點(diǎn)總數(shù)的 71.59%，這與童治軍等[19]利用 3份煙草基因組序列數(shù)據(jù)搜索的 SSR位點(diǎn)的基序結(jié)果一致，也與其他作物[3,9,30]基因組中SSR位點(diǎn)的分布特征相符。在SSR基序的結(jié)構(gòu)方面，共發(fā)現(xiàn)298種重復(fù)類型的基序，以T/A、AT/TA、TC/GA、CT/AG、AAT/ATT、AAC/GTT、ACA/TGT、GAA/TTC 和AAAT/ATTT基序最為豐富，此結(jié)果與前人在煙草基因組和EST序列研究所得的結(jié)果一致[15,19]，但與水稻[9,30]SSR位點(diǎn)中主要基序類型有所不同。另外，C型 SSR位點(diǎn)占總 SSR位點(diǎn)數(shù)的 6.65%，低于BOSAMIA等[31]在花生EST序列中檢測到10.38%的C型SSR位點(diǎn)，但未有在煙草基因組或EST序列研究中關(guān)于C型SSR位點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道。

本研究所獲得的reads和檢測到的SSR位點(diǎn)中的基序結(jié)構(gòu)中，均存在富含A、T和較低的G、C堿基的情況，且存在SSR位點(diǎn)的基序中G、C出現(xiàn)的越少，則該基序的分布頻率越高的現(xiàn)象；這一現(xiàn)象在多種真核生物基因組SSR位點(diǎn)中也有發(fā)現(xiàn)[32]。形成這一現(xiàn)象的原因可能是與GC、AT堿基對之間所含的能量相關(guān)，即AT比GC更容易變動(dòng)[19,32]。

3.2 SSR標(biāo)記的開發(fā)和多態(tài)性SSR標(biāo)記

隨著新一代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，測序的成本和時(shí)間大大減少，基于基因組序列開發(fā)SSR標(biāo)記的方法已經(jīng)成為植物研究中 SSR標(biāo)記開發(fā)的重要手段[33-34]。雖然煙草全基因組測序已經(jīng)完成[35]，并可根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)出大量的SSR引物組合。但由于常規(guī)栽培煙草品種之間親緣關(guān)系較近，可用的SSR標(biāo)記多態(tài)性水平低，從而造成一些研究成本的增加。如劉文杰等[36]選用 1405對由 BINDLER等[1,5]和TONG等[37]開發(fā)的SSR引物對煙草青枯病進(jìn)行定位時(shí)，只發(fā)現(xiàn)214（15.23%）對SSR引物在兩親本材料間（“118-3”和“粵煙 98”）具有多態(tài)性。TONG等[38]選用5718對依據(jù)基因組數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR引物，對煙草赤星病進(jìn)行QTL定位時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有227對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，多態(tài)率僅為3.96%。劉文杰等[17]選用90對前人開發(fā)的SSR引物分析94份煙草核心種質(zhì)資源的遺傳多樣性時(shí)，只有17對引物檢測出34個(gè)等位變異位點(diǎn)，平均PIC值只有0.2811。本研究利用簡化基因組測序技術(shù)開發(fā)和設(shè)計(jì)出23 346對SSR標(biāo)記引物，并依據(jù)兩個(gè)測序樣品間的序列數(shù)據(jù)，初步發(fā)現(xiàn) 323對引物的SSR位點(diǎn)具有多態(tài)性，以減少在引物合成及其篩選的成本和工作量。在利用 4份煙草材料對多態(tài)性SSR進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)在兩份測序樣品中多態(tài)率達(dá)到76%，并發(fā)現(xiàn)24%的假陽性，可能是因?yàn)闇y序結(jié)果有一定的錯(cuò)誤率造成，或者是多態(tài)性驗(yàn)證時(shí)所采用的 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的分辨率不足，造成一部分多態(tài)性SSR標(biāo)記驗(yàn)證結(jié)果錯(cuò)誤[38]。同時(shí)，在另外兩份種質(zhì)材料中也發(fā)現(xiàn)了20%的多態(tài)率，該比率高于牟建英等[39]在“臺(tái)煙 7號(hào)”和“NC89”兩份煙草材料間得到的 4.8%以及高亭亭等[40]在“Beinhart1000-1”和“小黃金 1025”兩份煙草材料間得到的7.2%。值得說明的是，多態(tài)性SSR在4份材料之間的多態(tài)率高達(dá)84%，表明開發(fā)的多態(tài)性標(biāo)記不僅能夠用于兩個(gè)測序材料的后續(xù)基因定位，也能用于種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)，基因組或EST序列中SSR位點(diǎn)的重復(fù)序列長度與所開發(fā)出 SSR標(biāo)記的多態(tài)性有關(guān)，即SSR位點(diǎn)的重復(fù)序列越長，多態(tài)性出現(xiàn)的概率越大，且認(rèn)為當(dāng)SSR位點(diǎn)中重復(fù)序列長度≥20 bp，多態(tài)性的比例高[33,41]。本研究開發(fā)的323個(gè)多態(tài)性SSR中只有2個(gè)重復(fù)序列的長度低于20 bp，也表明重復(fù)序列的長度與其多態(tài)性相關(guān)。最后，單從多態(tài)性SSR開發(fā)和選用前人開發(fā)的 SSR的研究成本角度考慮，由于測序技術(shù)快速發(fā)展，測序分析開發(fā)多態(tài)性 SSR的研究成本顯著低于選用前人開發(fā)的 SSR標(biāo)記，尤其在遺傳距離較近的材料中。綜上所述，簡化基因組測序可快速高效開發(fā)煙草多態(tài)性 SSR標(biāo)記，為后續(xù)的 QTL定位和遺傳多樣性分析等研究提供基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過對兩份煙草材料“118-3”和“粵煙 98”進(jìn)行簡化基因組測序，共檢測到25 343個(gè)SSR位點(diǎn)，依據(jù)序列設(shè)計(jì)出23 346對SSR標(biāo)記引物組合；序列對比發(fā)現(xiàn)其中323對SSR引物組合在兩份測序材料間具有多態(tài)性，試驗(yàn)驗(yàn)證表明其多態(tài)率為76%。研究結(jié)果表明，簡化基因組測序可為煙草具有多態(tài)性SSR標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用提供參考，亦可為后續(xù)的QTL定位和遺傳多樣性分析等研究提供基礎(chǔ)。

[1] BINDLER G, HOEVEN V, GUNDUZ I, et al.Microsatellite marker based linkage map of tobacco[J].Theoretical and Applied Genetics, 2007, 114(2)∶ 341-349.

[2] SONG Q J, JIA G F, ZHU Y L, et al. Abundance of SSR motifs and development of candidate polymorphic SSR markers (BARCSOYSSR_1.0) in soybean[J]. Crop Science, 2010, 50(5)∶ 1950-1960.

[3] EUIJAY I, SORRELLS M E, BAUM M, et al. Isolation of EST-derived micro-satellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2002, 104(2)∶ 399-407.

[4] SINGH A K, SINGH P K, ARYA M, et al. Molecular screening of blast resistance genes in rice using SSR markers[J]. Plant Pathology Journal, 2015, 31(1)∶ 12-24.

[5] BINDLER G, PLIESKE J, BAKAHER N, et al. A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacumL.)obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2011,123(2)∶ 219-230.

[6] 吳超，夏巖石，李榮華，等. 煙草青枯病抗性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析[J]. 煙草科技，2015，48（10）：1-12.WU C, XIA Y S, LI R H, et al. Association analysis of tobacco bacterial wilt resistance with molecular markers[J]. Tobacco Science & Technology, 2015,48(10)∶ 1-12.

[7] QIAN Y L, WANG X S, WANG D Z, et al. The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco (Nicotiana TabacumL.)[J]. Euphytica, 2013,192(2)∶ 259-266.

[8] LAN T, ZHENG S P, YANG L, et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to bacterial wilt in tobacco (Nicotiana tabacumL.)[J]. Plant Breeding,2015, 133(5)∶ 672-677.

[9] KANTETY R V, ROTA M L, MATTHEWS D E, et al.Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat[J]. Plant Molecular Biology, 2002, 48(5)∶ 501-510.

[10] CHEN H M, LI L Z, WEIX Y, et al. Development,chromosome location and genetic mapping of EST-SSR markers in wheat[J]. Chinese Science Bulletin, 2005,50(20)∶ 2328-2336.

[11] 王衛(wèi)鋒，晁江濤，龔達(dá)平，等. 絨毛狀煙草基因組中SSR位點(diǎn)的信息分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2011，32（3）：32-35，40.WANG W F, CHAO J T, GONG D P, et al. Analysis of SSR information inN.tomentosiformisgoodspeed genome[J]. Chinese Tobacco Science, 2011, 32(3)∶ 32-35,40.

[12] 童治軍，肖炳光. 3種煙草基因組SSR位點(diǎn)信息分析和標(biāo)記開發(fā)[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2014，34（8）：1549-1558.TONG Z J, XIAO B G. Survey of SSR loci information in three tobacco genomes and development of SSR markers[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2014, 34(8)∶ 1549-1558.

[13] 張俊娥，李芬，孫蒙祥. 煙草EST-SSR位點(diǎn)分析[J]. 武漢植物學(xué)研究，2007，25（5）：427-431.ZHANG J E, LI F, SUN M X. Analysis of EST-SSR loci in tobacco (Nicotiana tabacumL)[J]. Journal of Wuhan Botanical Research, 2007, 25(5)∶ 427-431.

[14] 胡重怡，蔡劉體，陳興江. 煙草ESTs資源的SSR信息分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2009，25（7）：82-85，93.HU C Y, CAI L T, CHEN X J. Analysis of SSR information in ESTs resource of tobacco (Nicotiana tabacum)[J]. Biotechnology Bulletin, 2009, 25(7)∶ 82-85,93

[15] 薛金愛，趙彥宏. 煙草SSR分布特征與開發(fā)利用[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（4）：295-298，306.XUE J A, ZHAO Y H. Distribution characteristics and utilization of SSRs inNicotiana tabacum[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2011, 39(4)∶ 295-298, 306.

[16] MOON H S, NICHOLSON J S, HEINEMAN A, et al.Changes in genetic diversity of U.S. Flue-cured tobacco germplasm over seven decades of cultivar development[J]. Crop Science, 2009, 49(2)∶ 498-508.

[17] 劉文杰，李榮華，夏巖石，等. 利用熒光SSR和MFLP標(biāo)記技術(shù)分析煙草核心種質(zhì)的遺傳多樣性[J]. 分子植物育種，2016，14（10）：2869-2881.LIU W J, LI R H, XIA Y S, et al. Analysis of genetic diversity for core tobacco germplasm by using fluorescent SSR and fluorescent MFLP marker techniques[J]. Molecular Plant Breeding, 2016, 14(10)∶2869-2881.

[18] MOON H S, NIFONG J M, NICHOLSON J S, et al.Microsatellite-based analysis of tobacco (Nicotiana tabacumL.)genetic resources[J]. Crop Science, 2009,49(6)∶ 2149-2159.

[19] 童治軍，焦芳嬋，肖炳光. 普通煙草及其祖先種基因組SSR 位點(diǎn)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（11）：2108-2117.TONG Z J, JIAO F C, XIAO B G. Analysis of SSR loci inNicotina tabacumgenome and its two ancestral species genome[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(11)∶2108-2117.

[20] ALTSHULER D, POLLARA V J, COWLES C R, et al. An SNP map of the human genome generated by reduced representation shotgun sequencing[J]. Nature, 2000,407(6803)∶ 513-516.

[21] ELSHIRE R J, GLAUBITZ J C, SUN Q, et al. A robust,simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for high diversity species[J]. PloS ONE, 2011, 6(5)∶ e19379.

[22] MILLER M R, DUNHAM J P, AMORES A, et al. Rapid and cost-effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA (RAD)markers[J]. Genome Res, 2007, 17(2)∶ 240-248.

[23] 王洋坤，胡艷，張?zhí)煺? RAD-seq技術(shù)在基因組研究中的現(xiàn)狀及展望[J]. 遺傳，2014，36（1）：41-49.WANG Y K, HU Y, ZHANG T Z. Current status and perspective of RAD-seq in genomic research[J]. Hereditas,2014, 36(1)∶ 41-49.

[24] BARCHI L, LANTERI S, PORTIS E, et al. Identification of SNP and SSR markers in eggplant using RAD tag sequencing[J]. Bmc Genomics, 2011, 12(1)∶ 304.

[25] URASAKI N, GOEKU S, KANESHIMA R, et al. Leaf margin phenotype-specific restriction-site-associated DNA-derived markers for pineapple (Ananas comosusL.)[J].Breeding Science, 2015, 65(3)∶ 276-284.

[26] GUPTA S K, BAEK J, ACARRASQUILLA-GARCI N, et al. Genome-wide polymorphism detection in peanut using next-generation restriction-site-associated DNA (RAD)sequencing[J]. Molecular Breeding, 2015, 35(7)∶ 145.

[27] 趙偉才，邱妙文，陳杰，等. 烤煙新品種粵煙98的選育及其特征特性[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2013，19（4）：35-40.ZHAO W C, QIU M W, CHEN J, et al. Breeding of new flue-cured tobacco variety Yueyan98 and its characteristics[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2013, 19(4)∶35-40.

[28] 李榮華，夏巖石，劉順枝，等. 改進(jìn)的 CTAB提取植物DNA方法[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2009，28（9）：14-16.LI R H, XIA Y S, LIU S Z, et al. CTAB-improved method of DNA extraction in plant[J]. Research and Exploration in Laboratory, 2009, 28(9)∶ 14-16.

[29] 郭培國，劉文杰，李海洋，等. 一種快速有效檢測 SSR標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染方法[J]. 廣州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，15（4）：8-12.GUO P G, LIU W J, LI H Y, et al. A rapid and effective method of silver staining for detecting SSR markers in nondenaturing polyacrylamide gels[J]. Journal of Guangzhou University(Natural Science Edition), 2016,15(4)∶ 8-12.

[30] LAWSON M J, ZHANG L Q. Distinct patterns of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genomes[J].Genome Biology, 2006, 7(2)∶ R14.

[31] BOSAMIAT C, MISHRA G P, THANKAPPAN R, et al.Novel and stress relevant EST derived SSR markers developed and validated in peanut[J]. PloS One, 2015, 10(6)∶e0129127.

[32] TOTH G, GASPARI Z, JURKA J. Microsatellites in different eukaryotic genomes∶ survey and analysis[J].Genome Research, 2000, 10(7)∶ 967-981.

[33] 李榮華，王直亮，陳靜芳，等. 菜薹轉(zhuǎn)錄組中 SSR信息與可用性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43（9）：1816-1824.LI R H, WANG Z L, CHEN J F, et al. Analysis of SSR information in transcriptome and their usability in flowering Chinese cabbage[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(9)∶1816-1824.

[34] 米奇，龍志成，MUCHUKU J K，等. 基于新一代高通量測序技術(shù)開發(fā)巨人半邊蓮Lobelia deckenii的SSR標(biāo)記[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，33（6）：847-854.MI Q, LONG Z C, MUCHUKU J K, et al. Development of SSR markers in giant lobeia(Lobeia deckenii) based on next-generation high-through sequencing[J]. Plant Science Jounal, 2015, 33(6)∶ 847-854.

[35] SIERRO N, BATTEY J N, OUADI S, et al. The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato[J]. Nature Communications, 2014, 5(5)∶ 3833.

[36] 劉文杰. 煙草遺傳圖譜的構(gòu)建及青枯病抗性與一些農(nóng)藝性狀的QTL定位[D]. 廣州：廣州大學(xué)，2017.LIU W J. Construction of linkage genetic map and QTL mapping for bacterial wilt resistance and some agronomic traits in tobacco[D]. Guangzhou∶ Guangzhou University,2017.

[37] TONG Z J, YANG Z M, CHEN X J, et al. Large-scale development of microsatellite markers inNicotiana tabacumand construction of a genetic map of flue-cured tobacco[J].Plant Breeding, 2012, 131(5)∶ 674-680.

[38] TONG Z J, JIAO T L, WANG F Q, et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in flue-cured tobacco (Nicotiana tabacumL.)[J]. Plant Breeding, 2012, 131(2)∶ 335-339.

[39] 牟建英，錢玉梅，任民，等. 煙草白粉病抗性基因的QTL定位[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2013，19（4）：105-108.MU J Y, QIAN Y M, REN M, et al. QTL analysis of resistance gene to powdery mildew in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2013, 19(4)∶ 105-108.

[40] 高亭亭，蔣彩虹，羅成剛，等. 煙草品種 Beinhart1000-1抗黑脛病基因的QTL定位[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16（2）：330-335.GAO T T, JIAN C H, LUO C G, et al. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to black shank in tobacco line Beinhart1000-1[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2015, 16(2)∶ 330-335.

[41] SINGH H, DESHUMUKH R K, SINGHA, et al. Highly variable SSR markers suitable for rice genotyping using agarose gels [J]. Molecular Breeding, 2010, 25 (2)∶ 359-364.