Box-Behnken法優(yōu)選川烏、草烏、馬錢子超聲提取工藝△

汪坤，趙旭，王楠斐，胡昌江

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

現(xiàn)代藥理研究表明，川烏[1]、草烏[2]、馬錢子[3]均具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤作用，為中醫(yī)臨床治療癌癥和緩解癌性疼痛的常用藥物。河南省中醫(yī)院腫瘤科以川烏、草烏、馬錢子為主藥研制的消積止痛膏緩解癌性疼痛效果顯著，但原制劑為黑膏藥，現(xiàn)擬把飲片進行提取之后制成巴布劑。

文獻報道中有同時提取川烏、草烏，單獨提取馬錢子的工藝研究，而尚未有對三者同時提取的研究。本研究擬同時提取3種飲片，以烏頭堿、士的寧、馬錢子堿提取量的綜合評分為指標，優(yōu)選提取工藝，為同時包含川烏、草烏、馬錢子的中藥制劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

川烏、草烏的藥效成分為烏頭堿等雙酯型生物堿類成分，該類成分易水解，當溶劑的pH值、溫度升高可以加速其水解過程[4-5]；馬錢子的藥效成分為士的寧、馬錢子堿等生物堿類成分[5]。本實驗采用超聲提取法，以酸水為溶媒，在低溫、低pH值的條件下優(yōu)化川烏、草烏、馬錢子的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient-1260高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)；AE240型十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；PL-S60超聲波清洗機(東莞康士潔超聲波科技有限公司)。

1.2 試藥

烏頭堿對照品、士的寧對照品、馬錢子堿對照品(四川維克奇生物科技有限公司，批號分別為110718-201108、110718-201108、110718-201108，純度均≥98%)；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水。

川烏、草烏、馬錢子購于亳州藥材市場，經(jīng)河南省中醫(yī)院黃小敏副主任中藥師鑒定分別為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根、毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥塊根、馬錢科植物馬錢Strychnosnux-vomicaL.的干燥成熟種子。

2 方法

2.1 色譜條件

AgilentTC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸二氫鈉(B)；采用梯度洗脫(0～10 min，12%A；10～11 min，12%A→36%A；11～18 min，36%A；18～20 min，36%A→12%A)；檢測波長分別為0～8 min時260 nm(測定士的寧、馬錢子堿)，8～20 min時235 nm(測定烏頭堿)；柱溫25 ℃，流速1 mL·min-1。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱烏頭堿、士的寧、馬錢子堿對照品，色譜甲醇定容置于容量瓶中，質(zhì)量濃度分別為0.2、0.0168、0.05 mg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

稱取草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g，按照正交試驗設(shè)計的條件進行超聲提取，提取液氨水堿化后過濾，濾液三氯甲烷萃取后收集三氯甲烷層，定容于50 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.4 陰性樣品溶液的制備

分別稱取川烏、草烏，馬錢子，按照2.3項下方法制備缺川烏、草烏，缺馬錢子陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗

取混合對照品溶液、樣品溶液及陰性對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣分析，士的寧、馬錢子堿、烏頭堿峰形對稱，無雜質(zhì)干擾且基線平穩(wěn)，保留時間分別為6.72、7.49、14.69 min，見圖1，方法專屬性良好。

注：A.混合對照品；B.樣品；C.缺馬錢子陰性樣品；D.缺川烏、草烏陰性樣品；1.士的寧；2.馬錢子堿；3.烏頭堿。圖1 混合對照品、樣品、陰性樣品HPLC圖

2.6 標準曲線的制備

分別精密移取2.2項下混合對照品溶液0.6、1.0、1.2、1.8、2.0 mL于10 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容至刻度，制得不同濃度的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，計算峰面積值，并以混合對照品溶液濃度(X)對峰面積值(Y)回歸，得回歸方程見表1。

表1 線性關(guān)系

2.7 精密度試驗

取對照品溶液重復(fù)進樣6次，每次10 μL，按2.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子堿峰面積的RSD分別為1.35%、1.11%、1.08%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

稱取草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g，按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8、10 h后進樣，進樣量10 μL，按2.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子含量的RSD值分別為1.68%、2.37%、2.54%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

稱取樣品6份，其中草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g，按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，按2.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子含量的RSD值分別為2.22%、1.97%、1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知烏頭堿、士的寧、馬錢子含量的樣品6份，分別加入一定量烏頭堿、士的寧、馬錢子堿對照品溶液，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別進樣10 μL，按照2.1項下色譜條件條件測定，計算平均加樣回收率分別為2.17%、2.26%、1.98%。

3 實驗結(jié)果

3.1 單因素試驗

3.1.1 超聲功率 固定鹽酸水濃度為1.5%，加液量10倍，提取時間1 h，稱取樣品5份，草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g。按照供試品溶液的制備方法分別在超聲功率200、300、400、500、600 W下提取制備樣品溶液，分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子含量，結(jié)果見表2，發(fā)現(xiàn)超聲功率600 W時提取效率最佳。

表2 超聲功率對川烏、草烏、馬錢子提取的影響

3.1.2 酸濃度 固定提取時間1 h，加液量10倍，稱取樣品5份，草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g。分別加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的鹽酸水溶液，超聲功率600 W，按照供試品溶液的制備方法制備樣品溶液。分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子含量，結(jié)果見表3。選擇鹽酸水濃度1%、1.5%、2%為星點設(shè)計-響應(yīng)面法試驗的水平條件。

表3 酸濃度對川烏、草烏、馬錢子提取的影響

3.1.3 提取時間 固定鹽酸水濃度為1.5%，加液量10倍，稱取樣品5份，草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g，超聲功率600 W，按照供試品溶液的制備方法分別提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，制備樣品溶液，分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子含量，結(jié)果見表4，選擇提取時間1、1.5、2 h為星點設(shè)計-響應(yīng)面法試驗的水平條件。

表4 提取時間對川烏、草烏、馬錢子提取的影響

3.1.4 加液量 固定鹽酸水濃度為1.5%，提取時間1 h，稱取樣品5份，草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g，分別加入6、8、10、12、15倍量的鹽酸水溶液，超聲功率600 W，按照供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子含量，結(jié)果見表5，選擇加液量8、10、12倍為星點設(shè)計-響應(yīng)面法實驗的水平條件。

表5 加液量對川烏、草烏、馬錢子提取的影響

3.1.5 提取次數(shù) 固定鹽酸水濃度為1.5%，加液量10倍，提取時間1 h，稱取樣品5份，其中草烏、川烏各3 g，馬錢子1 g，按照供試品溶液的制備方法分別提取1、2、3次，制備樣品溶液，分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算烏頭堿、士的寧、馬錢子含量，提取兩次后烏頭堿、士的寧、馬錢子的提取率達到90%以上，為了降低成本、提高生產(chǎn)效率，因此選擇提取2次。

3.2 星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化川烏、草烏、馬錢子超聲提取工藝

3.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酸水濃度(A)、提取時間(B)、加液量(C)為因變量，烏頭堿、士的寧、馬錢子提取量的綜合評分為相應(yīng)值設(shè)計三因素三水平中心復(fù)合試驗，見表6。

表6 Box-Behnken試驗因素水平表

3.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析 根據(jù)Box-Behnken法設(shè)計方案及2.1.3項下供試品溶液的制備方法進行實驗，測定烏頭堿、士的寧、馬錢子堿的含量，計算綜合評分，響應(yīng)試驗結(jié)果見表7。采用Design Expert 8.06軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，方差分析結(jié)果見表8。

表7數(shù)據(jù)經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件回歸分析，并進行擬合，得到以上3個因素對提取工藝綜合評分影響的回歸模型方程：Y=0.222 7+0.508 85A+0.418 35B+0.011 625C-0.064AB-2.75×10-3AC-3.75×10-3BC+3.750×10-3-0.133A2-0.127 2B2-5.125×10-4C2，方差分析結(jié)果見表8所示。

由表8可知，B、A2、B2對綜合評分的的影響極顯著(P<0.01)，A、AB對綜合評分的的影響較顯著(P<0.05)。本實驗?zāi)Ｐ突貧wP值為<0.01，說明模型回歸顯著可靠；失擬誤差P值為0.027 7>0.05，說明失擬度不明顯；說明該方程擬合度較高，實驗誤差較小，該模型可以有效地對川烏、草烏、馬錢子提取工藝進行分析和預(yù)測。

表8 回歸系數(shù)的顯著性檢驗

注：*P<0.05為顯著水平，**P<0.01為極顯著水平。

3.2.3 響應(yīng)面分析 經(jīng) Design Expert 8.0.6軟件回歸分析，分別繪制各指標與響應(yīng)值的響應(yīng)曲面圖，用來確定各因素對川烏、草烏、馬錢子提取工藝綜合評分的影響，結(jié)果見圖2～4。由圖可知，提取時間一定時，綜合評價結(jié)果隨酸濃度的增加先升高后降低；加液量一定時，綜合評價結(jié)果隨提取時間的增加先升高后降低；酸濃度一定時，綜合評價結(jié)果隨超聲功率的增加先升高后趨于平穩(wěn)。

圖2 提取時間與酸濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖3 加液量與酸濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖4 加液量與提取時間交互作用的響應(yīng)面圖

3.2.4 工藝驗證 經(jīng) Design Expert 8.0.6軟件得到的回歸方程，求解得到草烏、川烏、馬錢子最佳超聲提取工藝：以1.41%的鹽酸水為溶媒，超聲功率600 W，11.99倍加液量提取2次，每次1.46 h，此時綜合評分的預(yù)測值為0.968。根據(jù)實際生產(chǎn)情況修正最佳提取工藝：1.4%的鹽酸水為溶媒，超聲功率600 W，12倍量的加液量提取2次，每次1.5 h。

按修正工藝進行3批驗證，結(jié)果見表9，綜合評分平均值為0.961，RSD值為0.82%。結(jié)果表明，建立的綜合評分與酸濃度、加液量和提取時間之間關(guān)系的回歸模型是科學(xué)合理的。

表9 驗證實驗結(jié)果

4 討論

川烏、草烏所含的藥效成分烏頭堿易水解，隨著溫度的升高，水解速度加快。目前對川烏、草烏常用的提取方法有冷浸法[7]、超聲提取法、滲漉法、回流提取法等，其中回流提取法烏頭堿水解速度較快；而冷浸法、滲漉法所用溶劑較多，用時較長，因此本實驗采用超聲波提取法，提取效率較高。

馬錢子的提取工藝研究中采用的溶劑有水、酸水、乙醇等，酸水提取效率略低于乙醇提取，但二者之間無顯著差異[8]。

本實驗采用超聲提取法用酸水提取川烏、草烏、馬錢子中的生物堿類成分，浸泡時間較短，提取液同回流提取法相比較為粘稠，但采用減壓過濾法可以快速過濾，優(yōu)選的工藝簡便易行，可以為制劑生產(chǎn)提供參考。

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