連翹花中連翹苷的超聲提取工藝△

高首勤，雒慧娟，陳芳

(1.山西中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001)

連翹(Forsythia suspense)為木犀科連翹屬的落葉灌木，在我國(guó)分布廣泛，主要產(chǎn)地有山西、陜西、河南、山東等，而且其他各地幾乎均有栽培。連翹的傳統(tǒng)入藥部位是果實(shí)，是經(jīng)常使用的中藥[1]。連翹最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱解毒、散結(jié)消腫之功能，主治癰疽、乳癰、瘰疬、癰瘍腫毒、丹毒、高熱煩渴、風(fēng)熱感冒、神昏發(fā)斑以及熱淋尿閉等癥[2]。近些年來(lái)，關(guān)于連翹果實(shí)與連翹葉的研究很多，包括有效成分和藥理作用等方面。研究表明，連翹果實(shí)與連翹葉所含的化合物非常相似，均含有苯乙醇苷類(lèi)、木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)以及三萜類(lèi)等化學(xué)成分[3]，而且都具有降血脂、保肝、抗氧化、抗疲勞和抗腫瘤等作用[4]。然而相比之下，對(duì)連翹花的研究文獻(xiàn)卻甚少，連翹每年的花期為3—4月份，花期長(zhǎng)、花量大，花色鮮黃且長(zhǎng)時(shí)間不褪色，是一類(lèi)及其豐富的資源，可以將其收集起來(lái)加以開(kāi)發(fā)和利用。連翹苷是從連翹中提取分離出的一種活性成分，難溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑[5]，具有良好的抗菌、抗炎、保肝、抗病毒和降血脂等功能[6-8]。根據(jù)宋小俊等[9]的報(bào)道，連翹花中也含有連翹苷且含量高于傳統(tǒng)入藥部位。但是目前關(guān)于連翹花中連翹苷的提取工藝研究報(bào)道卻很少。

超聲波提取法由于其具有費(fèi)時(shí)短、低耗能、高效率、不破壞有效成分等優(yōu)點(diǎn)，在中藥化學(xué)成分的提取中表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。為了更加全面地開(kāi)發(fā)和利用連翹花資源，本文采用正交試驗(yàn)法對(duì)連翹花中連翹苷的超聲提取工藝展開(kāi)了研究，為更有效地開(kāi)發(fā)和合理利用連翹花資源提供依據(jù)。文獻(xiàn)中提取的溶劑常用的有水、甲醇、乙醇等，其中對(duì)連翹花和葉的提取用甲醇的比較多，所以本文選取甲醇作為提取劑，當(dāng)然提取成分用于藥用要考慮到甲醇的毒性。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

CP214電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；UV-61005紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；SB-5200DTDN型超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DE-200g萬(wàn)能高速粉碎機(jī)﹙浙江紅景天工貿(mào)有限公司﹚。

1.2 試劑與藥品

連翹花采于山西中醫(yī)學(xué)院榆次校區(qū)本草園內(nèi)，洗凈，40 ℃烘干，粉碎備用；連翹苷對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：160403)；無(wú)水甲醇為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 連翹花中連翹苷的提取

取新鮮連翹花，洗凈，40 ℃烘干，粉碎，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取連翹花粉末1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，浸泡1 h，超聲波提取30 min，過(guò)濾，將濾液置于100 mL容量瓶中，定容，搖勻，作為樣品溶液，備用。

2.2 連翹花中連翹苷的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的連翹苷對(duì)照品5.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.500 mg·mL-1的連翹苷對(duì)照品溶液。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取2.2.1項(xiàng)中制備好的對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在290 nm波長(zhǎng)處有最大吸收且干擾小，故選擇290 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于10 mL容量瓶中，定容，搖勻，以甲醇為空白對(duì)照溶液，在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以連翹苷對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)得到回歸方程：Y=8.476 2X+0.002 1，r=0.996 9，表明連翹苷對(duì)照品在0.01～0.07 mg·mL-1呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取配置好的對(duì)照品溶液在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，平行操作6次，算得RSD值為1.05%，說(shuō)明此儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取連翹花供試品溶液2 mL，定容到10 mL容量瓶中，在290 nm波長(zhǎng)下分別間隔0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度值，計(jì)算得RSD值為1.28%，說(shuō)明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定，所得連翹苷的穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一批藥材樣品，依據(jù)連翹花供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，然后分別在290 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算得RSD值為1.56%，說(shuō)明此方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別在6份已知含量的重復(fù)性樣品中，精密移取連翹苷對(duì)照品溶液1.500 mg加入樣品中，在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.3 單因素試驗(yàn)

在其他條件相同時(shí)，分別選取甲醇濃度、超聲時(shí)間和料液比3個(gè)影響提取效果的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以期為正交試驗(yàn)中因素水平的設(shè)定提供參考。

2.3.1 不同甲醇濃度提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g連翹花粉末5份，以1∶20的料液比分別加入50%、60%、70%、80%、90%的甲醇，分別超聲提取30 min。提取液過(guò)濾后，取2 mL濾液置于10 mL容量瓶中，定容，搖勻，在290 nm處測(cè)定吸光度值并計(jì)算提取率，見(jiàn)圖1，使用70%的甲醇提取率最高。

2.3.2 不同時(shí)間提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g連翹花粉末5份，以1∶20的料液比分別加入70%的甲醇，分別超聲提取20、30、40、50、60 min。提取液過(guò)濾后，取2 mL濾液置于10 mL容量瓶中，定容，搖勻，在290 nm處測(cè)定吸光度值并計(jì)算提取率，見(jiàn)圖2，超聲提取30 min時(shí)，提取率最高。

2.3.3 不同料液比提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g連翹花粉末5份，分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比加入70%的甲醇，分別超聲提取30 min。提取液過(guò)濾后，取2 mL濾液置于10 mL容量瓶中，定容，搖勻，在290 nm處測(cè)定吸光度值并計(jì)算提取率，見(jiàn)圖3，料液比1∶25時(shí)提取率最高。

圖1 甲醇濃度與連翹苷得率的關(guān)系

圖2 時(shí)間與連翹苷得率的關(guān)系

圖3 料液比與連翹苷得率的關(guān)系

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為系統(tǒng)考察超聲波提取連翹花中連翹苷的提取工藝，在單因素試驗(yàn)與所查文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間、甲醇濃度和料液比作為考察因素，以連翹苷提取率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定連翹花中連翹苷的最佳超聲提取工藝條件，因素水平見(jiàn)表2。

按表2所列的工藝組合制備樣品，加甲醇后均浸泡1 h后超聲提取，提取物取2 mL置于10mL容量瓶中，定容，搖勻。在290 nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算連翹苷的提取率。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

按表3所列的工藝組合制備樣品，加甲醇后均浸泡1 h后超聲提取，提取物取2 mL置于10 mL容量瓶中，定容，搖勻。在290 nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算連翹苷的得率。正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果和直觀分析

表4 方差分析

由結(jié)果分析可知，影響連翹苷得率的主次因素為：料液比>提取時(shí)間>甲醇濃度，其中最顯著的影響因素為料液比，并且確定最佳提取方案為A2B2C3，即用25倍量的70%甲醇，超聲提取40 min，提取的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.822 mg·g-1。

3 討論

采用超聲提取法對(duì)連翹花中連翹苷的提取工藝進(jìn)行研究，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳的超聲波提取工藝，即用25倍量70%的甲醇，超聲提取40 min，提取率為4.822 mg·g-1。這個(gè)提取工藝的確定不但為連翹花資源的合理開(kāi)發(fā)和利用提供了可靠的參考，而且擴(kuò)大了連翹苷的藥用來(lái)源。

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