星點設(shè)計-響應(yīng)曲面法優(yōu)化沙棘果渣總黃酮的提取工藝△

孫琛，寧靜，宋忠興，謝培，唐志書*

(1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046)

沙棘HippophaerhamnoidesL.為胡頹子科(Elaeagnaceae)酸刺屬的灌木或小喬木，又名沙棗、醋柳果、酸刺、黑刺，常生長在海拔2500～4300 m[1-2]。在很多本草文獻中記載沙棘果實具有養(yǎng)胃、祛痰、健脾和活血化瘀等功能，所以我國的藏醫(yī)和蒙醫(yī)都將沙棘果實作為藥物來使用。沙棘果實中的活性成分有黃酮類和維生素類化合物[3]。其中最重要的一種有效的生物活性成分就是沙棘總黃酮(Total Flavonoids of Hippophae，TFH)。沙棘果渣是沙棘果汁、沙棘油等沙棘產(chǎn)品的加工副產(chǎn)物，其中含有大量的活性物質(zhì)，如果將沙棘果渣作為廢棄物丟棄，對沙棘資源是一種浪費，也會對環(huán)境造成污染[4-6]。至今，從沙棘果渣中提取黃酮類化合物的研究已有不少報道[7-10]，而采用星點設(shè)計-響應(yīng)曲面法優(yōu)化沙棘果渣總黃酮的提取工藝未見報道。為實現(xiàn)廢棄物的再利用，本次實驗主要采用Box-Behnken統(tǒng)計學方法考察指標和4個因素之間的數(shù)學關(guān)系，繪制了響應(yīng)曲面圖，優(yōu)化沙棘果渣總黃酮的提取方法，對沙棘果渣黃酮類產(chǎn)品的進一步研究具有指導意義，并促進沙棘相關(guān)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展，還能夠達到保護環(huán)境的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(日本島津 UV-2600)；電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

沙棘果渣；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201409)。

2 方法

2.1 標準曲線繪制

精密稱取5 mg蘆丁對照品，放入容量瓶(50 mL)中，加入乙醇(70%)定容至刻度，搖勻，得到對照品溶液0.1 mg·mL-1。分別吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加入亞硝酸鈉溶液(5%，5 mL)，搖勻，靜置10 min；再加入硝酸鋁溶液(10%，0.5 mL)，搖勻，靜置10 min；加入氫氧化鈉(4%，5 mL)，用乙醇(70%)定容至刻度，搖勻，放置15 min。

2.2供試品溶液制備

稱取沙棘果渣1 g，放入錐形瓶中，加入乙醇，超聲60 min，抽濾，濾液倒入100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度，吸取1 mL，測定其總黃酮含量按照標準曲線項下處理。

2.3 沙棘總黃酮提取的單因素試驗

2.3.1 料液比對提取率的影響 精確稱取沙棘果渣1 g，6份，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，溶劑為70%的乙醇，超聲提取60 min。提取液按照上述方法測定總黃酮含量。

2.3.2 乙醇濃度對提取率的影響 精確稱取沙棘果渣1 g，6份，分別放入錐形瓶中，加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比為1∶60，超聲提取60 min。提取液按照上述方法測定總黃酮含量。

2.3.3 提取溫度對提取率的影響 精確稱取沙棘果渣1 g，6份，放入錐形瓶中，料液比1∶60，加入70%乙醇，分別置于40、50、60、70、75、80 ℃超聲提取60 min。提取液按照上述方法測定總黃酮含量。

2.3.4 提取時間對提取率的影響 精確稱取沙棘果渣1 g，6份，放入錐形瓶中，分別提取20、40、60、90、120、180 min，料液比1∶60，加入70%乙醇，提取溫度70 ℃。提取液按照上述方法測定總黃酮含量。

2.4 響應(yīng)面法對總黃酮提取條件進行優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度4個因素，根據(jù)BBD(Box-Behnken design)的中心組合實驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)曲面法在4因素3水平上對沙棘果渣總黃酮提取工藝進行優(yōu)化。見表1。

表1 星點設(shè)計因素與水平

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線的繪制

以沙棘果渣總黃酮濃度(X)為橫坐標，吸光值(Y)為縱坐標，在510 nm處測吸光度，得到的線性回歸方程為：Y=1.221 6X+0.003 2，Y為吸光度，X為對照品蘆丁濃度(mg·mL-1)，r=0.999 2，說明標準曲線線性關(guān)系良好。

3.2 沙棘果渣總黃酮提取的單因素試驗

3.2.1 乙醇濃度對提取率的影響 將提取次數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比等因素固定，研究乙醇濃度對沙棘果渣總黃酮提取率的影響。研究結(jié)果說明，綜合考慮提取效果與提取率，選取70%的乙醇為最佳提取濃度，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

3.2.2 提取時間對提取率的影響 固定乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)及溫度等因素，在不同提取時間下研究其對沙棘果渣總黃酮提取率的影響。結(jié)果顯示，在提取時間為60 min左右時，黃酮提取率最大。綜合考慮資源節(jié)省及提取效果的因素，確定提取時間為60 min，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對總黃酮得率的影響

3.2.3 料液比對提取率的影響 固定乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)-溫度等因素，研究料液比對沙棘果渣總黃酮提取率的影響。綜合考慮提取率、提取效果和節(jié)省資源的關(guān)系，最終確定最佳提取料液比為1∶60，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對總黃酮得率的影響

3.2.4 提取溫度對提取率的影響 固定乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)等因素，在不同提取溫度下研究其對沙棘果渣總黃酮的影響。結(jié)果顯示，提取溫度在70 ℃時提取率較高，最終確定提取溫度為70 ℃，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對總黃酮提取率影響

3.3 星點設(shè)計試驗及結(jié)果

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用BBD對沙棘果渣總黃酮提取工藝中的乙醇濃度、料液比、提取時間、溫度這4個因素進一步優(yōu)化。以A：料液比、B：提取時間、C：提取溫度、D：乙醇濃度為自變量，以沙棘果渣總黃酮的提取率為響應(yīng)值R，結(jié)果見表2。

表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 響應(yīng)面模型的方差分析

表4 回歸模型方差分析

根據(jù)表4及表5的分析結(jié)果顯示，PA、PB、PAC、PAD、PBC、PBD、PA2、PB2、PC2、PD2、PA2B的值均小于0.05，說明料液比和提取時間這兩個因素對沙棘果渣提取率的影響是顯著的；四因素的二次項均小于0.000 1，說明對提取率影響很顯著；交互項PAC、PAD、PBC、PBD均小于0.001說明對提取率影響非常大。

圖5～12很直觀地給出了A、B、C、D各因素交互作用的等高線分析圖和3D效應(yīng)面圖。根據(jù)模型分析，提取條件的取值為A(料液比)=1∶45、B(提取時間)=3 h、C(提取溫度)=65 ℃、D(乙醇濃度)=70%，理論上沙棘果渣總黃酮的最大提取率為1.4%。

在上述條件下進行提取，重復進行試驗，對本模型進行可靠性驗證，得到沙棘果渣總黃酮的平均提取率為1.31%，與理論值的誤差為1.33%，表明本試驗的回歸方程能夠很好地預測沙棘果渣總黃酮的提取率。

圖5 提取溫度和料液比對沙棘果渣總黃酮提取率影響的等高線

圖6 提取溫度和料液比對沙棘果渣總黃酮提取率影響的效應(yīng)面圖

圖7 乙醇濃度和料液比對沙棘果渣總黃酮提取率影響的等高線

圖8 乙醇濃度和料液比對沙棘果渣總黃酮提取率影響的效應(yīng)面圖

圖9 提取溫度和提取時間對沙棘果渣總黃酮提取率影響的等高線

圖10 提取溫度和提取時間對沙棘果渣總黃酮提取率影響的效應(yīng)面圖

圖11 乙醇濃度和提取時間對沙棘果渣總黃酮提取率影響的等高線

圖13 乙醇濃度和提取時間對沙棘果渣總黃酮提取率影響的效應(yīng)面圖

4 結(jié)論

沙棘現(xiàn)在廣泛應(yīng)用在食品、化妝品、日用品、醫(yī)藥等各行各業(yè)[11]，而作為加工中的副產(chǎn)物沙棘果渣被廢棄，但是沙棘果渣中含有大量的活性物質(zhì)，有研究表明，沙棘果渣中的黃酮成分有較好的降血糖作用。為實現(xiàn)資源回收循環(huán)利用，本實驗研究提取沙棘果渣黃酮的最佳提取工藝，最終確定其提取條

件為A(料液比)=1∶45、B(提取時間)=3 h、C(提取溫度)=65 ℃、D(乙醇濃度)=70%。根據(jù)響應(yīng)曲面法的擬合方程優(yōu)化出的最佳提取工藝參數(shù)不為整數(shù)，為了做到在實驗中操作方便，將最佳提取工藝參數(shù)均確定為近似整數(shù)。本實驗為以后進一步合理利用沙棘資源提供了依據(jù)。

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