不同采收期龍葵藥材質(zhì)量研究

王玨，金一寶，王鐵杰*，李曉帆

(1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057 2.深圳大學(xué) 深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060)

龍葵，茄科植物龍葵SolanumnigrumL.的干燥地上部分[1]，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰的功效[2]。近期研究證實(shí)其具有較好的抗腫瘤活性[3]。目前對(duì)其抗腫瘤活性成分的研究集中在皂苷類(lèi)成分[4]和甾體生物堿類(lèi)成分[5]等。龍葵是一年生草本植物，一年四季都可在栽培，但是其采收期對(duì)藥材的質(zhì)量有較大影響。因此，為獲得具有最佳治療效果的藥材，需要對(duì)龍葵的采收期進(jìn)行研究。中藥材采收期的研究，以中藥所含化學(xué)成分作為質(zhì)量控制依據(jù)，并與藥理學(xué)緊密結(jié)合。高效液相色譜法(HPLC)先分離后分析的特點(diǎn)也特別適用于中藥成分的含量測(cè)定及指紋圖譜研究。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)不同生長(zhǎng)周期的龍葵中的龍葵中的主要活性成分進(jìn)行分析，以便更好的控制龍葵藥材的最佳采收期，為龍葵藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

共采集到不同采收期(6月至10月)的樣品共8批。龍葵藥材由沈陽(yáng)藥科大學(xué)吳維春老師鑒定為SolanumnigrumL.。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本島津株式會(huì)社，SEDEX MODEL 75，二元梯度泵LC-10ATVP)，色譜柱選用Phenomendex C18(4.6×250 mm，5 μm)。色譜級(jí)甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，色譜級(jí)乙腈(迪馬公司)，色譜級(jí)三乙胺(Fisher Scientific)，蒸餾水，無(wú)水乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，DPBS、PMS、MTS(含Ca2+、Mg2+，德國(guó)賽默飛公司)。去氫表雄酮-β-石蒜四糖苷、澳洲茄堿、澳洲茄邊堿和去半乳糖替告皂苷由龍葵提取物中分離得到[6-7]，并經(jīng) IR、NMR、HPLC等技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)和含量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于 99.0%。

2 方法

2.1 細(xì)胞毒活性篩選

2.1.1 試劑的配制 PMS，將PMS溶解于DPBS中，配制成0.92 g·mL-1，過(guò)濾除菌。MTS，取250 g溶于125 mL的DPBS，混勻15 min，過(guò)濾除菌。

龍葵溶液，干燥的龍葵粉碎后過(guò)2號(hào)篩，再真空干燥12 h，取藥材粉末加60%乙醇超聲提取，微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，取續(xù)濾液使用，最終給藥濃度為100 μg·mL-1。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(v/v)中，置5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×104，待貼壁后，每孔加入藥物作用于細(xì)胞48 h，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。采用MTS法，利用[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carbosym-ethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，innersalt]形成的水溶性甲臢產(chǎn)物。吸出所有培養(yǎng)液，加入50 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL MTS-PMS(20∶1，臨用現(xiàn)配)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于490 nm波長(zhǎng)處讀取數(shù)據(jù)，扣除背景值后。

比較按2.11所制備的不同采收期的龍葵溶液對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率。同時(shí)對(duì)從龍葵中分離得到的化合物去氫表雄酮-β-石蒜四糖苷(allopregnenolone β-lycotetraoside)、澳洲茄堿(solasonine)、澳洲茄邊堿(solamarging)，去半乳糖替告皂苷，測(cè)定單體化合物對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率，用Logit法以藥理學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。

2.2 活性成分含量分析

2.2.1 色譜條件 Phenomendex C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相A 相為乙腈(含0.03%三乙胺)，B 相為水/甲醇=8∶2(含0.03%三乙胺)，二元線性梯度洗脫(洗脫程序：0～10 min，A相10%至15%；10～15 min，A相15%至30%；15～30 min，A相30%至34%；30～52 min，A相34%至50%；52～55 min，A相50%至55%)，柱溫25 ℃，蒸發(fā)光檢測(cè)器蒸發(fā)管溫度設(shè)置40 ℃，進(jìn)樣量20 μL[8]。

2.2.2 龍葵溶液的制備 干燥的龍葵藥材，粉碎后過(guò)2號(hào)篩，再真空干燥12 h，取藥材粉末，每份2.0 g，精密稱(chēng)定。加60%乙醇20 mL，超聲提取2次，每次20 min。過(guò)濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至近干，用60%乙醇轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加60%乙醇定容，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液 取減壓干燥至恒重的從龍葵中提取分離的去半乳糖替告皂苷對(duì)照品適量，去半乳糖替告皂苷對(duì)照品由前期實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離制得，經(jīng)HPLC-ELSD測(cè)定，通過(guò)峰面積計(jì)算其純度為99.2%。精密稱(chēng)定去半乳糖替告皂苷對(duì)照品，加甲醇定溶至50 mL容量瓶中，制成1.001 mg·mL-1的去半乳糖替告皂甙溶液。

2.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL至10 mL量瓶中，以起始流動(dòng)相溶液定容至10 mL，進(jìn)樣體積20 μL，測(cè)定峰面積Y。以對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。精密度試驗(yàn)，取50.05 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，在上述色譜條件測(cè)定峰面積計(jì)算RSD值。重現(xiàn)性試驗(yàn)，取8月19日采集的同一批樣品，精密稱(chēng)取6份，按2.2.2項(xiàng)下操作，在上述色譜條件測(cè)定去半乳糖替告皂苷的含量，計(jì)算RSD值。穩(wěn)定性試驗(yàn)，精密吸取同一供試品試液，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、24、48 h時(shí)測(cè)定去半乳糖替告皂苷的含量計(jì)算RSD值?；厥章试囼?yàn)，精密稱(chēng)取6份8月19日的龍葵藥材，分別加入50.05 μg·mL-1濃度的對(duì)照品溶液混合，按2.2.2項(xiàng)下操作，測(cè)定去半乳糖替告皂苷的回收率。

2.2.5 樣品測(cè)定 按2.2.2制備不同采收期龍葵藥材供試品溶液，每個(gè)采收期各制備3份。分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算不同采收期龍葵藥材中去半乳糖替告皂苷的量。

2.2.6 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 通過(guò)提取各色譜圖，導(dǎo)入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版本)”，進(jìn)行相似度計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒活性測(cè)試

3.1.1 不同采收期龍葵藥材活性評(píng)價(jià) 對(duì)6～10月期間不同采收期的龍葵藥材進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)周期的不同對(duì)龍葵的細(xì)胞毒活性有較大的影響，且隨著生長(zhǎng)周期的變化，細(xì)胞毒活性呈現(xiàn)出一定的趨勢(shì)性，即從7月開(kāi)始出現(xiàn)明顯增強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，活性水平維持一定水平直到9月初，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同采收期的龍葵藥材對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率

3.1.3 龍葵抗癌活性成分 比較龍葵中活性化合物去氫表雄酮-β-石蒜四糖苷(allopregnenolone β-lycotetraoside)、澳洲茄堿(solasonine)、澳洲茄邊堿(solamarging)和去半乳糖替告皂苷(degalactotionin)的IC50值，結(jié)果見(jiàn)表1，去半乳糖替告皂苷的IC50值最小(IC50=0.245±0.59 μmol·L-1)，即對(duì)龍葵的細(xì)胞毒活性影響最顯著。

表1 活性化合物的IC50值

3.2 不同采收期活性成分量值差異

3.2.1 測(cè)定成分的選擇 龍葵全草乙醇提取物具有較好的活性，其中化合物1、2、3、4為藥材中含有的細(xì)胞毒活性成分[3]，其中化合物4(去半乳糖替告皂苷)的活性最強(qiáng)。因此選擇其進(jìn)行含量測(cè)定，作為控制該藥材質(zhì)量的定量指標(biāo)。

3.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 吸取去半乳糖替告皂甙對(duì)照品溶液和龍葵藥材供試品溶液，分別注入液相色譜儀，繪制色譜圖，此條件下各對(duì)照品及其它組分達(dá)到良好分離，分離度R值大于1.5，理論板數(shù)按去半乳糖替告皂甙計(jì)算不低于6000，進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL至10 mL量瓶中，以起始流動(dòng)相溶液定容至10 mL，分別取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以去半乳糖替告皂甙的峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)、進(jìn)樣溶度μg·mL-1為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，去半乳糖替告皂甙回歸方程為 Y=1.252X+12.68，r=0.999 6。結(jié)果表明，去半乳糖替告皂甙在 10.01～200.2 μg·mL-1呈良好線性。

3.2.4 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算去半乳糖替告皂甙的RSD，結(jié)果見(jiàn)表2，RSD為1.44%，符合精密度要求。

3.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取沈陽(yáng)產(chǎn)龍葵藥材(8月19日采摘)6份，制備供試品溶液，計(jì)算化合物去半乳糖替告皂甙的RSD為2.42%(見(jiàn)表2)，表明方法重復(fù)性較好。

3.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 室溫下分別放置0、1、4、8、12、24 h后，計(jì)算其中去半乳糖替告皂苷面積的RSD為1.95%(見(jiàn)表2)，表明穩(wěn)定性較好。

3.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已測(cè)8月19日樣品6份，每個(gè)樣品分別精密加入另配制的去半乳糖替告皂苷對(duì)照品溶液5.0 mL，按樣品測(cè)定項(xiàng)下操作，依法測(cè)定，計(jì)算回收率為98.8%(見(jiàn)表2)，表明方法回收率較好。

表2 去半乳糖替告皂苷測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證

3.3 不同采收季節(jié)對(duì)藥材的影響

3.3.1 指紋圖譜相似度比較 為了考察不同的采收季節(jié)對(duì)龍葵藥材次生代謝的影響，收集不同時(shí)期的8批龍葵藥材，分別掃描HPLC指紋圖譜，見(jiàn)圖3。

圖3 不同采收期龍葵藥材色譜圖(箭頭所指為去半乳糖替告皂苷)

將以上不同采收期的8批藥材，通過(guò)提取各色譜圖，導(dǎo)入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版本)”，進(jìn)行相似度計(jì)算(見(jiàn)表3)，并建立指紋圖譜進(jìn)行比較。經(jīng)過(guò)相似度軟件處理可以看出不同采收期的龍葵藥材之間化學(xué)成分存在較大的差異，即從7月下旬至9月，龍葵藥材的相似度較好，在90%以上，而采收時(shí)間較早或較晚的相似度較差(見(jiàn)表3)。

3.3.2 去半乳糖替告皂苷含量比較 活性化合物去半乳糖替告皂苷的IC50值最小，即對(duì)龍葵的細(xì)胞毒活性影響最顯著。通過(guò)測(cè)定不同采收期的龍葵藥材化合物去半乳糖替告皂苷含量的結(jié)果見(jiàn)表3。從7月開(kāi)始，龍葵藥材內(nèi)的去半乳糖替告皂苷含量開(kāi)始升高，在7月下旬達(dá)到峰值后，緩慢下降。

表3 不同采收期龍葵的指紋圖譜相似度和去半乳糖替告皂苷含量

4 討論

Oween[9]等設(shè)計(jì)的MTT類(lèi)似物——MTS，與MTT法相比，操作簡(jiǎn)便，易于配制和儲(chǔ)存，相比MTT法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好[10]。經(jīng)過(guò)對(duì)不同采收期的龍葵藥材的細(xì)胞毒活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)周期的不同對(duì)龍葵的細(xì)胞毒活性有較大的影響，并且隨著生長(zhǎng)周期的變化，細(xì)胞毒活性呈現(xiàn)出一定的趨勢(shì)性。為了闡明其中的細(xì)胞毒活性成分，對(duì)龍葵藥材的化學(xué)成分進(jìn)行研究，確定去半乳糖替告皂苷的細(xì)胞毒活性最強(qiáng)，為后續(xù)含量測(cè)定奠定基礎(chǔ)利用HPLC技術(shù)對(duì)龍葵藥材進(jìn)行分析，方法學(xué)考察證明本方法的各項(xiàng)指標(biāo)良好。通過(guò)指紋圖譜的相似性可明顯看出不同采收期的龍葵藥材具有顯著差異。同時(shí)利用HPLC對(duì)龍葵的中的主要細(xì)胞毒活性化合物去半乳糖替告皂苷進(jìn)行含量分析，發(fā)現(xiàn)去半乳糖替告皂苷的含量隨生長(zhǎng)時(shí)間而發(fā)生變化，因此，推測(cè)龍葵藥材的細(xì)胞毒活性隨采收期的時(shí)間變化的原因就是其藥效成分量值變化所導(dǎo)致的。

為了比較不同采收期對(duì)藥材的影響，將不同采收期藥材相似度，活性化合物去半乳糖替告皂苷的含量與抑制率擬合成的相關(guān)趨勢(shì)線如圖4。如圖所示，龍葵藥材隨采收日期的變化其相似度值呈規(guī)律性變化。這種規(guī)律性的變化揭示了藥材的生長(zhǎng)周期。從圖4可以看出，在6月下旬至7月上旬采集的藥材相似度很低，相似度值在0.5以下，7月中旬至8月初采集的藥材相似度攀升，8月5日采集的藥材相似度達(dá)到0.994。從8月初至9月中旬，均有較高的相似度，相似度位于0.95以上。到了9月末相似度呈下降的趨勢(shì)，10月5日采集的藥材相似度為0.814，已經(jīng)低于0.85。根據(jù)藥材相似度結(jié)合不同采收期藥材的活性變化趨勢(shì)線，基本上可以確定藥材的采收期為7月上旬至9月初。然而通過(guò)觀察活性化合物去半乳糖替告皂苷的含量變化，發(fā)現(xiàn)去半乳糖替告皂苷的含量高低對(duì)藥材活性也有較大的影響，但是隨著進(jìn)入8月后，龍葵藥材中的去半乳糖替告皂苷的含量開(kāi)始逐漸減少，但其藥效作用依然保持至9月初，說(shuō)明在龍葵藥材中其它皂苷類(lèi)、茄堿類(lèi)成分雖然不具備最強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但可能由于后續(xù)的含量累計(jì)維持了龍葵的抗癌活性。

圖4 不同采收期龍葵藥材的相關(guān)趨勢(shì)比較

通過(guò)細(xì)胞毒活性測(cè)試，指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)和最強(qiáng)活性成分的含量測(cè)定三個(gè)方面相結(jié)合對(duì)固定產(chǎn)地不同采收期的龍葵藥材進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了不同采收期對(duì)藥材的品質(zhì)具有影響，為今后龍葵的研究與開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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