夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息分析

王會(huì)敏，蘇秀紅，2，董誠明，2，朱畇昊，2*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

夏枯草為唇形科夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，味辛、苦，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫的功能[1]。廣泛分布于全國各地，主產(chǎn)于江蘇、河南、浙江、安徽等地[2]。夏枯草既是臨床常用中藥材，又是藥食兩用之品，具有獨(dú)特的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來我國夏枯草市場(chǎng)需求量呈增加態(tài)勢(shì)，使得夏枯草野生資源逐漸變得稀少。因此，急需加強(qiáng)對(duì)夏枯草種質(zhì)資源的保護(hù)和利用。目前夏枯草研究主要集中在栽培、質(zhì)量評(píng)價(jià)、臨床應(yīng)用、化學(xué)成分研究及藥理作用等方面[3]，遺傳多樣性研究和分子標(biāo)記研究有廖麗等[4]利用ISSR方法分析夏枯草種質(zhì)間的遺傳多樣性；賴江琴等[5]對(duì)夏枯草不同品種間進(jìn)行RAPD分析；江建銘、沈宇峰等利用AFLP方法對(duì)夏枯草進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[6-7]。目前尚缺乏對(duì)夏枯草進(jìn)行可以大規(guī)模種質(zhì)鑒定、分子標(biāo)記輔助育種、功能基因定位等的具有種屬特異性的分子標(biāo)記研究。

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)又稱微衛(wèi)星(microsatellite)，是一種由1～6個(gè)核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)單元，廣泛分布在真核和原核生物基因組中[8]。SSR標(biāo)記是較為理想的遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量豐富、重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)、可靠性高和共顯性遺傳易于分析等特點(diǎn)，成為構(gòu)建連鎖遺傳圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種、分析系譜、繪制品種指紋圖譜等的理想工具[9]。常用的SSR標(biāo)記主要有基因組SSR(genomic-SSR)和轉(zhuǎn)錄組SSR(EST-SSR)；轉(zhuǎn)錄組SSR避免了基因組SSR標(biāo)記引物開發(fā)需要構(gòu)建文庫所帶來的步驟繁瑣、工作量大、成本高及大量人力、物力和時(shí)間投入的缺點(diǎn)，同時(shí)轉(zhuǎn)錄組SSR多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)，在不同物種間具有良好的通用性[10]。本研究基于夏枯草轉(zhuǎn)錄組文庫高通量測(cè)序結(jié)果，利用MicroSAtellite(MISA)軟件搜索夏枯草SSR位點(diǎn)信息，分析其分布、組成特征，并進(jìn)行初步可用性評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上開發(fā)設(shè)計(jì)夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR引物，以期為夏枯草遺傳多樣性研究和分子標(biāo)記輔助育種提供參考和基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 夏枯草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本采自于河南省確山縣夏枯草GAP種植基地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為唇形科夏枯草PrunellavulgarisL.。夏枯草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自于課題組前期利用Illumina HiSeq2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)夏枯草莖、葉、果穗進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Trinity軟件進(jìn)行從頭組裝，得到共含32 336 280 bp核苷酸的Unigene(>1 kb)5450條。

1.2 方法

使用軟件MISA(Micro Satellite identification tool，http：//www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)夏枯草轉(zhuǎn)錄組中序列長度在1 kb以上的Unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，并利用軟件Primer3對(duì)搜索到的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。所檢測(cè)SSR位點(diǎn)包括單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)6類。設(shè)置參數(shù)為單核苷酸重復(fù)至少10次、二核苷酸重復(fù)至少6次；三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)至少5次；五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)至少4次。復(fù)合SSR兩個(gè)位點(diǎn)間最大間隔堿基數(shù)為100。將生成的文本文件導(dǎo)入到Excel(Microsoft Office Excel 2016)表中，對(duì)查找到的SSR位點(diǎn)信息進(jìn)行特征分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 夏枯草轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)數(shù)量與分布頻率

利用軟件MISA搜索夏枯草轉(zhuǎn)錄組序列SSR位點(diǎn)，設(shè)置的SSR最小長度均不小于12 bp。從總長度約32.34 Mb的15 443條轉(zhuǎn)錄組Unigene序列(序列長度>1 kb)中搜索到5450個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于4248條Unigene序列中，SSR發(fā)生頻率(含有SSR的Unigene數(shù)目與總Unigene的數(shù)目之比)為27.5%，出現(xiàn)頻率(檢出SSR個(gè)數(shù)與總Unigene數(shù)目之比)為35.29%。平均每相隔5.9 kp出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)，復(fù)合型SSR有267個(gè)，其中3329條Unigenes含有單個(gè)SSR，919條Unigenes含有2個(gè)或2個(gè)以上的SSR。

夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型較多，單核苷酸重復(fù)至六核苷酸重復(fù)都有出現(xiàn)，所占比例變化較大。從SSR位點(diǎn)數(shù)量上看，二核苷酸、三核苷酸及單核苷酸重復(fù)是其優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，分別有2430、1550、1349個(gè)，合計(jì)占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的97.78%。其中以二核苷酸重復(fù)比例最高，占44.59%；其次是三核苷酸重復(fù)和單核苷酸重復(fù)，分別為28.44%和24.75%。四、五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量較少，總計(jì)2.22%。見表1。

2.2 夏枯草轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)次數(shù)和基序長度特征

夏枯草轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)的序列總長度達(dá)到32 336 280 bp。基序重復(fù)次數(shù)的變異引起位點(diǎn)長度的變異是產(chǎn)生SSR多態(tài)性的主要原因[8]。分析發(fā)現(xiàn)，夏枯草轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)集中在5～11次，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，SSR位點(diǎn)數(shù)量隨基序長度和重復(fù)次數(shù)的變化總體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中以6次重復(fù)(1380個(gè))最多，占總SSR的25.32%，其次為重復(fù)次數(shù)5、10、7、8、11次，SSR位點(diǎn)數(shù)分別為1150、895、743、427、304個(gè)，占總SSR的21.1%、16.42%、13.63%、7.8%、5.58%。統(tǒng)計(jì)5～11次重復(fù)的SSR位點(diǎn)共有5144個(gè)，占94.39%；12～24次重復(fù)的SSR位點(diǎn)共有306個(gè)，占5.61%，見表2。

表1 夏枯草轉(zhuǎn)錄組中SSR統(tǒng)計(jì)

在夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR中共發(fā)現(xiàn)160種重復(fù)基元，一到六核苷酸重復(fù)分別有4、12、60、59、20、5種，從分布頻率上看，在5450個(gè)SSR位點(diǎn)中出現(xiàn)頻率最多的基元是AG/CT(1362個(gè)，約占25%)，其次是A/T(1322個(gè)，占24.26%)。二核苷酸重復(fù)中AG/CT占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次是AT/AT(640個(gè)，占11.74%)和AC/GT(425個(gè)，占7.8%)。三核苷酸重復(fù)中AAG/CTT出現(xiàn)頻率最高(394個(gè)，占7.23%)，其次是AGC/GCT(240個(gè)，占4.4%)和CCG/CGG(207個(gè)，占3.8%)。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸中各類重復(fù)基元出現(xiàn)頻率相對(duì)較低，均在0.3%以下。在夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR中，還發(fā)現(xiàn)3個(gè)CG/CG的二核苷酸重復(fù)基元。見表3和圖1。

表2 夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)分布圖

注：“-”表示SSR數(shù)量為0。

表3 夏枯草轉(zhuǎn)錄組中不同微衛(wèi)星重復(fù)基元(motif)出現(xiàn)的頻率

注：其他重復(fù)類型為出現(xiàn)頻率在0.3%以下的重復(fù)類型。圖1 夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR中不同重復(fù)基元類型及不同重復(fù)基元的分布

2.3 夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR可用性評(píng)價(jià)

SSR分子標(biāo)記在個(gè)體中是否具有多態(tài)性以及多態(tài)性的高低是判斷其可用性的重要依據(jù)，SSR片段長度是影響其多態(tài)性高低的重要因素[11]，為了提高潛在的多態(tài)性差異，增加分析結(jié)果的實(shí)用性，本研究中只搜索長度在12 bp以上的SSR。結(jié)果表明，夏枯草轉(zhuǎn)錄組中所發(fā)現(xiàn)的5450個(gè)SSR中，微衛(wèi)星長度存在顯著變異。夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR大部分基序長度集中在12～20 bp，共有3199個(gè)，占75.97%；其次是21～30 bp，共有467個(gè)，占11.1%；30 bp以上的基序數(shù)量相對(duì)較少，共有545個(gè)，占12.94%。根據(jù)Temnykh等[12]提出的當(dāng)SSR長度大于或等于20 bp時(shí)多態(tài)性較高，長度在12～20 bp的SSR多態(tài)性中等，而長度在12 bp以下時(shí)多態(tài)性極低，研究結(jié)果表明夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR具有較高的多態(tài)性。

2.4 夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計(jì)

夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)的頻率較高，重復(fù)單元的類型較為豐富。從夏枯草轉(zhuǎn)錄組15 443條序列長度在1 kb以上的Unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共獲得5450個(gè)SSR位點(diǎn)，這些SSR位點(diǎn)分布在4248條序列上，平均分布距離為5.93 kb，出現(xiàn)頻率35.29%。為進(jìn)一步將篩選出的夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等分子育種相關(guān)的研究，我們對(duì)找出的SSR位點(diǎn)采用Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，每個(gè)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)引物，共得到4228對(duì)SSR位點(diǎn)特異性引物。部分引物序列信息見表4。

3 討論

本研究通過對(duì)夏枯草莖、葉、果穗3個(gè)樣本高通量測(cè)序組裝后序列長度在1 kb以上的Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)分布及序列特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從15 443條Unigenes中找到5450個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在4248條Unigenes中，平均距離為5.59 kb，跟其他檢索一至六核苷酸重復(fù)基元SSR的藥用植物相比，夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR的出現(xiàn)頻率明顯高于茯苓(1/17.01 kb)[13]、魚腥草(1/9.04 kb)[14]、膜莢黃芪(1/7.97 kb)[15]、連翹(1/7.9 kb)[16]、番紅花(1/5.67 kb)[17]；低于枇杷(1/5.52 kb)[18]、冬凌草(1/3.52 kb)[19]、藍(lán)靛果忍冬(1/2.58 kb)[20]、杜仲(1/0.73 kb)[21]：這表明夏枯草轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量比較豐富。除此之外，在夏枯草轉(zhuǎn)錄組序列長度在1 kb以上的15 443條Unigenes中找到5450個(gè)SSR位點(diǎn)，其出現(xiàn)頻率為35.29%，普遍較其他物種高，造成這種差異的原因，一方面可能與物種的特異性有關(guān)，還與搜索標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定、軟件類型、原始序列數(shù)據(jù)、長度不同有關(guān)[22]。

SSR位點(diǎn)多態(tài)性主要是因基元重復(fù)數(shù)和堿基數(shù)不同而形成的序列長度多態(tài)性[8]。夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR中，單核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)的重復(fù)次數(shù)類型相對(duì)較多且跨度大，如C/G有27種，跨度有10～24次；二核苷酸重復(fù)AG/CT有425種，6～17次。Xu等[23]認(rèn)為重復(fù)序列長度存在一個(gè)閾值，在20～30 bp，長度在閾值以下的SSR傾向于擴(kuò)張，序列長度在閾值以上的SSR傾向于收縮。夏枯草轉(zhuǎn)錄組中12～20 bp的SSR位點(diǎn)占75.97%，因而這些位點(diǎn)傾向于擴(kuò)張；長度在30 bp以上的SSR位點(diǎn)約占12.94%，這些位點(diǎn)傾向于收縮。根據(jù)上述觀點(diǎn)，夏枯草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)掘的5450個(gè)SSR位點(diǎn)大部分具有多態(tài)性潛能，能夠應(yīng)用于分子標(biāo)記研究。此外，在夏枯草轉(zhuǎn)錄組中，基序長度在20 bp以上的SSR位點(diǎn)達(dá)到1012條，占SSR總數(shù)的18.57%，并且其中有93.09%是多態(tài)性潛能較高的低級(jí)基元一、二、三核苷酸重復(fù)序列，這部分的SSR可以作為潛在的SSR重復(fù)基元加以開發(fā)利用。

表4 夏枯草EST-SSR部分引物序列

夏枯草轉(zhuǎn)錄組中SSR種類豐富，一至六核苷酸重復(fù)類型都有出現(xiàn)，二核苷酸、三核苷酸和單核苷酸重復(fù)是其優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，分別有2430、1550和1349個(gè)，占夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR總數(shù)的44.59%、28.44%、24.75%，這與魚腥草[14]、連翹[16]情況相似，與多數(shù)報(bào)道的以二、三核苷酸重復(fù)為主稍有不同，出現(xiàn)這種情況可能與物種主導(dǎo)重復(fù)類型差別有關(guān)；四、五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量較少，共計(jì)2.22%。在夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR中，AG/CT(1362個(gè)，占25.00%)出現(xiàn)的頻率最高，這與煙草、茶樹、馬尾松、杏樹、魚腥草[14]、半夏[8]、胡桃[24]、番紅花[17]、丹參[25]、浮萍[26]情況一樣，其次是A/T(1322個(gè)，占24.26%)；在二核苷酸重復(fù)中，除AG/CT外，AT/AT(640個(gè)，占11.74%)出現(xiàn)頻率最多，這與半夏[8]、杜仲[21]出現(xiàn)情況類似；在夏枯草轉(zhuǎn)錄組SSR中，三核苷酸重復(fù)種類繁多，其中以AAG/CTT(394，占25.42%)為主導(dǎo)，這與半夏[8]、杜仲[21]、番紅花[17]情況相類似。這種分布差異可能與物種的組成結(jié)構(gòu)有關(guān)，但也有可能與物種轉(zhuǎn)錄組SSR來源、SSR數(shù)目、密碼子偏倚、編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的使用頻率較高有關(guān)[22]。GC含量是堿基序列的重要特征之一，其反映基因的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化信息，GC分布不均會(huì)導(dǎo)致基因不同，GC含量序列不同其性質(zhì)和功能也有差異；在多個(gè)研究中均提到GC重復(fù)基元可能與脅迫抗性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)等特定功能相關(guān)[27]。GC在大多數(shù)植物中很難見到或者出現(xiàn)頻率較低[11，15]，本文中也僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)，出現(xiàn)頻率也很低，存在一定的偏倚。

綜上所述，在夏枯草轉(zhuǎn)錄組序列中存在豐富的SSR，且出現(xiàn)頻率高、密度大、類型多樣。同時(shí)參照前人研究結(jié)果對(duì)其多態(tài)性潛能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)具有較高的可用性。由于SSR引物在品種間具有較高的通用性，本研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)夏枯草SSR分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)，有助于夏枯草功能基因資源、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳多樣性研究等方面的研究。

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