CRISPR-Cas系統(tǒng)及其在結(jié)核分枝桿菌中的研究進展

翟小倩， 鮑 朗

(四川大學 華西醫(yī)學中心感染免疫研究室， 成都 610041)

結(jié)核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)是其主要的致病源。 2016年WHO全球結(jié)核報告指出：2015年，世界范圍內(nèi)估計有1040萬新發(fā)病例，新發(fā)病例中有120萬(11%)HIV患者。有140萬人死于結(jié)核病，其中40萬是結(jié)核/HIV雙重感染人群[1]。隨著結(jié)核-HIV病毒共同感染病人數(shù)量增加以及結(jié)核多重耐藥菌株流行，結(jié)核病的防治面臨嚴峻挑戰(zhàn)。因此，掌握結(jié)核病的發(fā)病機制是防治結(jié)核病的關(guān)鍵。

20世紀80年代，研究者在細菌基因組中首次發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas獲得性免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)在細菌抵御外源DNA入侵從而產(chǎn)生自我保護機制中發(fā)揮重要作用。迄今為止，CRISPR-Cas系統(tǒng)按作用機制中CAS蛋白的差異性分為I型、II型、III型三大類以及11種亞型[2]。結(jié)核分枝桿菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)屬于III-A型[3]。相關(guān)文獻表明，結(jié)核III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)不僅是一種獲得性免疫系統(tǒng)，還在結(jié)核毒力基因表達調(diào)控方面以及結(jié)核基因編輯方面均表現(xiàn)出重要作用，其功能呈現(xiàn)出多樣性與復(fù)雜性。

1 結(jié)核III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的簡介以及作用機制

結(jié)核III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)由兩大部分組成：CRISPR基因位點和CAS蛋白。CRISPR基因位點由前導(dǎo)序列、同向重復(fù)序列、間隔序列3部分組成。CAS蛋白由一系列保守的cas基因所編碼，是整個系統(tǒng)的催化核心[2]。CRISPR-Cas系統(tǒng)通過降解入侵的外源DNA來抵御其對宿主細胞的干擾，同時對其產(chǎn)生特異性免疫記憶，預(yù)防同類外源DNA的再次入侵[4]。不同類型CRISPR-Cas系統(tǒng)的具體作用機制不同， 本文主要介紹結(jié)核III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的具體作用機制,包括3大步驟：適應(yīng)、表達、干擾[5](如圖1)。

圖1 結(jié)核Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機制[5]Fig 1 The mechanism of Ⅲ-A type CRISPR-Cas system in mycobacterium tuberculosis[5]

第一步，適應(yīng)階段。由CAS1和CAS2組成的蛋白復(fù)合物裂解外源入侵的噬菌體和質(zhì)粒中的原型間隔序列(proto-spacer)，裂解后產(chǎn)生的新的間隔序列(new spacer)被整合到宿主基因組CRISPR位點的前導(dǎo)序列及第一個重復(fù)序列的近端。

第二步，表達階段。新的間隔序列被整合到CRISPR位點后，從前導(dǎo)序列開始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體crRNA (Pre-crRNA)，進一步通過CAS內(nèi)核糖核苷酸酶(CAS6為核心)剪切重復(fù)序列，最終形成由單個間隔序列和切割剩余的部分重復(fù)序列組成的成熟crRNA8[7]。同時，產(chǎn)生的新的間隔序列，如果能夠與CRISPR位點序列內(nèi)部的短重復(fù)序列部分互補，將被整合到細菌基因組的CRISPR序列中，產(chǎn)生對外源DNA入侵的特異性免疫記憶。

第三步，干擾階段。III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的主要作用單元是CSM6蛋白。成熟的crRNA與CAS蛋白結(jié)合形成的復(fù)合體(Csm復(fù)合體)，在成熟的crRNA的引導(dǎo)下，識別并結(jié)合在外源入侵的雙鏈DNA中緊隨原型間隔序列后的原型間隔序列毗鄰基序(proto-spacers adjacent motif，PAM)，進而CSM6(Rv2816編碼)通過切割外源DNA，達到抵御外源不利因素入侵的效果[8]?？傊?，III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的存在可以增強結(jié)核分枝桿菌的生存能力。

2 改造的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是目前研究熱門的新一代基因組編輯技術(shù)，屬于CRISPR-Cas系統(tǒng)的第II型。CRISPR-Cas9系統(tǒng)只需要一種CAS9蛋白和兩種RNA，即可實現(xiàn)對雙鏈DNA的精確切割。其作用機制簡單，容易進行體外設(shè)計和改造。即使宿主細胞內(nèi)無該系統(tǒng)，也可利用改造的CRISPR-Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)基因組編輯[9]。經(jīng)過改造的CRISPR-Cas9系統(tǒng)又稱為CRISPR干擾系統(tǒng) (CRISPR interference)，該系統(tǒng)應(yīng)用了無核酸酶活性的CAS9蛋白(“dead” CAS9，dCAS9)，dCAS9雖無核酸酶活性但可在RNA的指導(dǎo)下與特定靶向 DNA 序列結(jié)合[10]。將CRISPR干擾系統(tǒng)導(dǎo)入分枝桿菌后，dCAS9可以在分枝桿菌中穩(wěn)定存在2周且不產(chǎn)生毒性，最終實現(xiàn)基因編輯[11]。研究表明，在結(jié)核分枝桿菌中應(yīng)用CRISPR干擾系統(tǒng)能夠有效抑制多種功能基因的表達，能夠?qū)Χ鄠€基因進行同時敲除，也能夠快速檢測出必需基因[11]。該系統(tǒng)也可以沉默操縱子，結(jié)核groEL1位于groES下游， CRISPR干擾系統(tǒng)可直接通過沉默groESL1操縱子使groEL1的表達水平隨groES表達水平下降而下降[12]。因此，CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用對推動結(jié)核分枝桿菌的研究有里程碑式的意義。

3 結(jié)核III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因表達調(diào)控研究中的進展

結(jié)核III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以調(diào)控毒力基因的表達。Yosef等[5]認為CRISPR位點的轉(zhuǎn)錄和CAS蛋白都可以通過獨立的基因調(diào)節(jié)控制細菌的毒力。Hatoum-Aslan和Maniv[13]已經(jīng)證明CRISPR位點能夠調(diào)節(jié)基因的表達。Sampson等[14]的研究發(fā)現(xiàn)弗朗西斯氏菌屬的CAS9可以調(diào)節(jié)FTN_1103編碼的脂蛋白的表達。這些研究使得人們開始關(guān)注CRISPR-Cas系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中調(diào)節(jié)基因表達的作用。最近有研究表明，結(jié)核中的非編碼RNA可以影響結(jié)核基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。前文提到的crRNA就屬于非編碼RNA，而CRISPR基因位點是產(chǎn)生crRNA的主要來源，說明III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)在結(jié)核致病機制以及適應(yīng)性機制中有重要作用[15]。更加深入研究CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因表達中的調(diào)控作用，有助于探明結(jié)核分枝桿菌的作用機制從而實現(xiàn)結(jié)核病的防治。

4 結(jié)核III-A型CRSPR-Cas系統(tǒng)中cas基因的研究進展

全基因組測序發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌有4 411 529個堿基，大約4000個基因[15]。深入研究單個基因以及蛋白的生物學功能或者基因之間的相互作用機制成為探明結(jié)核發(fā)病機制的熱點。CAS蛋白家族作為CRSPR-Cas系統(tǒng)的催化核心，了解其各個基因及蛋白研究進展有助于更加全面地把握整個系統(tǒng)的作用，為進一步探明結(jié)核作用機制提供基礎(chǔ)。CAS蛋白家族由9種cas基因組成：cas2、cas1、csm6、csm5、csm4、csm3、csm2、cas10和cas6，具體如圖2[16]。這些CAS蛋白攜帶多種功能域，比如，核糖核酸酶、解螺旋酶、多聚酶等功能域以發(fā)揮作用[17]。

圖2 分枝桿菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成[16]Fig 2 The composition of CRISPR-Cas system of Mycobacterium[16]

4．1 Rv2816c-cas2

cas2對應(yīng)結(jié)核基因組中的Rv2816c。CAS2蛋白是一種內(nèi)核糖核苷酸酶，其二級結(jié)構(gòu)以及潛在的殘基對其自身的催化活性影響極大，為CRISPR-Cas系統(tǒng)功能正常發(fā)揮提供保障[18-19]。有研究者把cas2重組入恥垢分枝桿菌后，恥垢分枝桿菌的菌落表型以及生物膜形成發(fā)生明顯改變。因而推測cas2的功能涉及調(diào)節(jié)細胞壁合成的相關(guān)基因表達，造成恥垢分枝桿菌細胞壁組成結(jié)構(gòu)的改變，進而提高分枝桿菌自身毒力[20]。

4．2 Rv2817c-cas1

在CRISPR-Cas系統(tǒng)中，cas1是一種必需基因，也是序列最保守的cas基因，被認為是CRISPR-Cas系統(tǒng)的標志。cas1對應(yīng)結(jié)核基因組中的Rv2817c，其表達的CAS1蛋白是一種金屬依賴的核酸酶。CAS1蛋白通過和CAS2蛋白形成異聚體復(fù)合物從而獲取外源基因的原型間隔序列，實現(xiàn)抵御外源DNA入侵的作用[21]。也有研究報道CAS1蛋白的表達和活性極有可能被程序性細胞死亡和休眠機制所密切調(diào)控和關(guān)聯(lián)，具體機制不清楚[22-24]。

4．3 Rv2819c-Rv2820c

目前，Rv2819c和Rv2820c兩種基因被認為與結(jié)核分枝桿菌的毒力與基因組進化有關(guān)。在III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Rv2819c(csm5)和Rv2820c(csm4)，其表達的兩種CAS蛋白屬于同一類蛋白家族，在處理前體-crRNA的轉(zhuǎn)錄過程，承擔序列和結(jié)構(gòu)特異的RNA酶的功能[25]。Rindi等[26]通過比較基因組學研究發(fā)現(xiàn)，csm5在結(jié)核減毒株 H37Ra中的表達情況較在結(jié)核標準毒力株H37Rv中明顯下調(diào)，提示csm5可能與結(jié)核分枝桿菌的毒力有關(guān)。但分子流行病學研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥流行的臨床菌株——結(jié)核北京家族菌株RD207區(qū)缺失了7個cas，其中就包括csm5這個基因，其可能與結(jié)核家族種屬中的基因組進化有關(guān)[27-29]。發(fā)生這種缺失現(xiàn)象的另一個基因Rv2820c在結(jié)核標準毒力株H37Rv中基因片段是完整的，但在結(jié)核北京家族株中其同源的Rv2820c卻因為移碼突變，導(dǎo)致氨基酸的編碼改變產(chǎn)生基因截短，其長度只有原來的40%。Lam等[30]對截短的Rv2820c進行研究，發(fā)現(xiàn)無論是在體外還是體內(nèi)實驗中該基因均可以促進分枝桿菌的毒力。這種同源基因表現(xiàn)出不同表型差異的現(xiàn)象以及發(fā)生毒力改變是未來結(jié)核的研究熱點。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)作為獲得性免疫系統(tǒng)，通過抵御外援干擾入侵使得結(jié)核分枝桿菌的生存能力增強。同時，其組成成分CRISPR基因位點以及cas基因在一定程度上有助于結(jié)核分枝桿菌的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控以及調(diào)節(jié)菌體毒力。該系統(tǒng)作用的復(fù)雜性與多樣性使其研究更具意義。雖然結(jié)核北京家族株中存在不完整的CRISPR-Cas系統(tǒng)，使人推測CRISPR-Cas防御系統(tǒng)會隨著進化而消亡[31]，但是就目前的研究結(jié)果來看，這種基因組的進化是增強了CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用，該系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中的作用是不容忽視的。未來，對CRISPR-Cas系統(tǒng)的某種基因的功能或者基因之間相互作用進行深入研究，可能會尋找到治療靶點或者尋找到免疫原性極高的診斷指標。加之，改良的II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入結(jié)核分枝桿菌中可以實現(xiàn)高效的基因編輯(敲除或沉默基因)，利用該技術(shù)深入研究結(jié)核III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)將為解決結(jié)核病帶來的困擾提供更多理論支持。

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