云南丘北仙女蝦一物種的分子鑒定

李 蓉， 陳艷艷， 和忠廷， 楊洪福， 李春青， 曾本娟， 陳善元， 肖 蘅

(1. 云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 昆明 650091； 2. 云南省丘北縣漁業(yè)站， 丘北 663200)

仙女蝦(fairy shrimp)是無(wú)背甲目(Anostraca)所有成員的總稱，包括彎頭蟲科(Streptocephalidae)、釵額蟲科(Thamnocephalidae)、蝦仙科(Branchinectidae)等8科26屬300余種[1]，均屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，鰓足亞綱(Branchiopoda)[2-4]，其主要生活于臨時(shí)水域或季節(jié)性淹沒(méi)的洼地，生命周期較短，一般只能存活1～3個(gè)月，其卵粒耐凍耐旱，能在水體中存活數(shù)年甚至數(shù)十年。成年仙女蝦含有豐富的蛋白質(zhì)和必需氨基酸成分[5]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，幼體是魚、蝦及其他水生動(dòng)物良好的天然飼料[6-8]。但是由于仙女蝦物種的形態(tài)鑒定主要局限于成體，并且對(duì)于仙女蝦物種的鑒定主要依據(jù)顯著的幾個(gè)形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行區(qū)分，如彎頭蟲科物種的鑒定主要依據(jù)雄性觸角和四面體的卵進(jìn)行區(qū)分[9-11]，釵額蟲科物種主要依據(jù)前附肢和雄性第一對(duì)胸足進(jìn)行區(qū)分[12]。除了顯著的幾個(gè)特征之外，其余很多定性和定量的形態(tài)特征常常被忽略，對(duì)于形態(tài)相似的近緣種很難做到準(zhǔn)確地鑒定，加之現(xiàn)在很難找到全球統(tǒng)一公認(rèn)的物種分類相關(guān)資料，且隨著仙女蝦新種的不斷出現(xiàn)，采用形態(tài)特征對(duì)物種進(jìn)行鑒定存在一定困難。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于PCR技術(shù)的分子鑒定可用于相同物種內(nèi)和不同物種間細(xì)微差異的檢測(cè)，為物種的鑒定提供了有效手段[13-14]。線粒體DNA具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速率快、無(wú)重組、多拷貝及嚴(yán)格的母系遺傳等特點(diǎn)[15-18]，相比核DNA更適于進(jìn)化關(guān)系的分析研究。其中線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(Cytochrome coxidase subunit I，COI)基因的特定區(qū)域可作為DNA條形碼用于物種的鑒定[19]。例如，Vandergast等[20]運(yùn)用兩種多態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRs)擴(kuò)增mtDNA COI基因的特異性片段，很好地解決了分布于加利福尼亞州南部同一水域?yàn)l危仙女蝦Branchinectasandiegonensis、Branchinectalynchi、Branchinectalindahli的分類鑒定難題。Daniels等[21]利用線粒體COI基因和其他基因片段對(duì)仙女蝦Streptocephalus的物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，Streptocephalus的物種進(jìn)化于崗得瓦納，其分布格局是地理隔離和有限擴(kuò)散共同作用的結(jié)果。Alonso等[22]對(duì)仙女蝦Phallocryptustserensodnomi與近緣種P.spinosa進(jìn)行COI基因序列及形態(tài)學(xué)分析一致顯示，它們是兩個(gè)不同的物種。

COI基因作為遺傳標(biāo)記能夠很好地用于物種鑒定，然而某些因素的存在可能影響COI基因用于物種鑒定的有效性。由于COI是母系遺傳，漸滲雜交或譜系分揀可能會(huì)導(dǎo)致近緣種之間單倍型共享[23-24]。此外，線粒體DNA的核拷貝(NUMTs)中存在的終止密碼子、插入或缺失、非同義突變很容易被檢出，會(huì)導(dǎo)致物種數(shù)量的高估[25]。因此，以防COI基因不能對(duì)物種進(jìn)行有效鑒定，結(jié)合其他分子標(biāo)記進(jìn)行分析顯得十分重要。18S rDNA基因常被用于系統(tǒng)發(fā)育研究和生物多樣性分析的分子標(biāo)記之一[26]。例如，Sanoamuang等[3]對(duì)泰國(guó)Streptocephalussirindhornae進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)與印度S.dichotomus形態(tài)特征極為相似，通過(guò)SSU(18S)rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明S.sirindhornae與S.dichotomus、S.simplex的親緣關(guān)系較近。然而，近年來(lái)18S rDNA基因也被用于物種的分子鑒定，例如，Gebhardt等[27]利用18S rDNA基因和COI基因序列對(duì)來(lái)自北海和波羅的海Alloteuthis的物種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示Alloteuthis僅包含一個(gè)單物種。

云南省丘北縣漁業(yè)站的楊洪福等在云南丘北進(jìn)行魚類資源調(diào)查時(shí)，在天星鄉(xiāng)籠陶村水淹塘意外發(fā)現(xiàn)似蝦非蝦的物種，經(jīng)形態(tài)特征初步鑒定為一種仙女蝦“釵額蟲科、枝額蟲屬、枝額蟲”，后經(jīng)國(guó)內(nèi)外專家鑒定為“旋額蟲科、旋額蟲屬、旋額蟲”。云南丘北仙女蝦究竟為釵額蟲科枝額蟲還是旋額蟲科旋額蟲，有待進(jìn)一步明確。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)仙女蝦物種進(jìn)行研究報(bào)道的文獻(xiàn)僅有一篇[28]，并且對(duì)其種類鑒定尚未用到分子生物學(xué)手段。鑒于此，本研究以進(jìn)化速度較快的線粒體COI基因和相對(duì)保守的18S rDNA基因序列片段作為分子標(biāo)記，對(duì)云南丘北仙女蝦樣本進(jìn)行測(cè)序，基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST進(jìn)行相似性比對(duì)，并結(jié)合GenBank中已發(fā)表的相關(guān)同源序列，進(jìn)行序列特征、遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析，以期進(jìn)一步明確云南丘北仙女蝦物種的具體種類，為仙女蝦物種的準(zhǔn)確鑒定提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

本研究的樣本由云南丘北縣漁業(yè)站贈(zèng)送，總計(jì)30份(編號(hào)：YQ01～YQ30)，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為一種仙女蝦物種，樣本浸泡于95%的乙醇溶液中，-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)基于仙女蝦COI基因和18S rDNA基因序列，從GenBank中下載了該物種的已知同源序列(表1)。

表1 GenBank序列及其登錄號(hào)

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

取仙女蝦泳足組織約20～30 mg，用蒸餾水緩沖液洗凈泳足中的酒精，將其剪碎用超純水處理為細(xì)胞懸液，采用血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒提取基因組總DNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)和Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度和純度測(cè)定，將濃度大于60 ng/μL的DNA，稀釋至40 ng/μL工作液濃度之后，存于-20℃冰箱，用于之后的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

線粒體COI基因與18S rDNA基因的擴(kuò)增引物均為通用引物，線粒體COI基因的引物為L(zhǎng)CO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)；HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)[29]。18S rDNA基因的引物為NSI(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)；Fung(5′-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3′)[30]。所有引物均由上海捷瑞生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μL，包括10×Buffer 2.5 μL，線粒體COI基因與18S rDNA基因25 mmol/L的MgCl2分別為2.5 μL、3.5 μL，10 mmol/L的ddNTP Mix 2 μL，10 μmol/L的正反引物各0.5 μL，0.75 U ExTaq酶0.15 μL，DNA模板為2～3 μL，然后用超純水定容至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min;95℃變性1 min，線粒體COI基因與18S rDNA基因分別為40℃、45℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5 min。每次PCR擴(kuò)增都設(shè)置陰性對(duì)照，以防外源DNA分子的污染。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將膠置于UVP全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，選取條帶亮且單一的PCR產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用DNASTAR軟件包中的SeqMan進(jìn)行正反鏈校對(duì)和編輯，手動(dòng)去除序列兩端的引物區(qū)，獲得COI基因與18S rDNA基因序列有效長(zhǎng)度分別為658 bp和325 bp。采用NCBI在線BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行相似性比對(duì)分析，以確定擴(kuò)增序列的種類。將實(shí)驗(yàn)所得序列與GenBank中下載的同源序列利用Clustal X軟件進(jìn)行排序。采用MEGA6.06軟件將COI基因序列翻譯成蛋白序列，檢測(cè)是否有提前終止現(xiàn)象，計(jì)算堿基含量和遺傳距離，并采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，樹上各分支的支持率由Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1000次[31]。采用DnaSP v5軟件計(jì)算簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和單倍型數(shù)目。

2結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)與相似性比對(duì)

對(duì)云南丘北仙女蝦共30份樣本的COI基因與18S rDNA基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，所有實(shí)驗(yàn)樣本均可成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)所得的電泳圖效果良好，擴(kuò)增條帶清晰完整(圖1)。將比對(duì)好的COI基因與18S rDNA基因片段序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)與彎頭蟲科(Streptocephalidae)的Streptocephalussirindhornae相似度最高，分別為96%和100%，說(shuō)明云南丘北仙女蝦可初步確定為彎頭蟲科的Streptocephalussirindhornae。

2.2 COI基因與18S rDNA基因序列特征

對(duì)COI基因與18S rDNA基因序列分析顯示所有序列都未發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失。將COI基因序列翻譯成蛋白序列，檢測(cè)未包含終止密碼子，說(shuō)明未出現(xiàn)提前終止現(xiàn)象。在30個(gè)樣本的COI基因序列中共檢測(cè)到15個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，22個(gè)變異位點(diǎn)，分別占序列有效長(zhǎng)度(658 bp)的2.3%、3.3%，8個(gè)單倍型(YQH1～YQH8)，堿基A、T、C、G的平均含量分別為23.2%、38.2%、20.7%、17.9%，其中A+T含量(61.4%)大于G+C含量(38.6%)，說(shuō)明COI基因的堿基組成具有明顯的偏向性。而在30個(gè)樣本的18S rDNA基因序列中只檢測(cè)到1個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，1個(gè)變異位點(diǎn)，均占序列有效長(zhǎng)度(325 bp)的0.3%，2個(gè)單倍型(YQH1～YQH2)，堿基A、T、C、G的平均含量分別為25.7%、27.2%、23.7%、23.4%，其中A+T含量(52.9%)與G+C含量(47.1%)相當(dāng)，說(shuō)明18S rDNA基因的堿基組成無(wú)偏向性。

圖1 COI基因與18S rDNA基因部分仙女蝦的PCR擴(kuò)增條帶

A：COI基因PCR擴(kuò)增條帶；B：18S rDNA基因PCR擴(kuò)增條帶。CK：空白對(duì)照；M：分子標(biāo)記 DL 2000

2.3 遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA6.06軟件中的K2P(Kimura-2-parameter)模型計(jì)算不同仙女蝦物種的遺傳距離(表2)?；贑OI基因序列的結(jié)果顯示：云南丘北仙女蝦種內(nèi)平均遺傳距離為0.011；丘北仙女蝦與其他仙女蝦的種間遺傳距離范圍為0.043～0.211，其中與S.sirindhornae的種間遺傳距離最小，為0.043；與釵額蟲科T.platyurus的種間遺傳距離最大，為0.211。

表2 基于COI基因與18S rDNA基因序列計(jì)算的不同仙女蝦遺傳距離

對(duì)角線上方為不同仙女蝦18S rDNA基因序列的遺傳距離；對(duì)角線下方為不同仙女蝦COI基因序列的遺傳距離基于18S rDNA基因序列的結(jié)果顯示：云南丘北仙女蝦種內(nèi)平均遺傳距離為0.003；丘北仙女蝦與其他仙女蝦的種間遺傳距離范圍為0.002～0.033，其中與S.sirindhornae的種間遺傳距離最小，為0.002；與釵額蟲科T.platyurus的種間遺傳距離最大，為0.033。

選取釵額蟲科的Thamnocephalusplatyurus為外類群，基于COI基因與18S rDNA基因序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2和圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)云南丘北仙女蝦的單倍型序列都與泰國(guó)S.sirindhornae序列聚在一起，形成單系枝，支持率分別為100%和72%。丘北仙女蝦與S.sirindhornae聚為單系枝后同形態(tài)學(xué)上極為相似的印度S.dichotomus形成單系枝，支持率分別為97%和56%。

圖2 基于COI基因序列構(gòu)建的不同仙女蝦物種的NJ樹

圖3 基于18S rDNA基因序列構(gòu)建的不同仙女蝦的NJ樹

3討論

COI基因是線粒體DNA上的一段蛋白質(zhì)編碼基因。近年來(lái)隨著COI基因作為DNA條形碼概念的提出，因其線粒體DNA具有拷貝數(shù)量大、獨(dú)立于細(xì)胞核DNA等特點(diǎn)，被廣泛用于物種的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育的研究[19]。18S rDNA是真核生物染色體上編碼核糖體小亞基RNA的基因，因其DNA序列較為保守，被普遍用于高級(jí)階元的分子進(jìn)化和系統(tǒng)學(xué)的研究。本研究中，COI基因序列的堿基A+T含量(61.4%)明顯高于G+C含量(38.6%)，堿基組成的偏向性是線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的一個(gè)顯著特征，COI基因序列不包含終止密碼子，且未發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失，說(shuō)明本研究所測(cè)COI基因序列來(lái)源于線粒體，而非核基因序列。18S rDNA基因序列堿基組成同COI基因序列相比，G和C的含量明顯高于前者，且G+C含量(47.1%)與Sanoamuang等[3]對(duì)泰國(guó)仙女蝦18S rDNA基因序列研究得出的G+C含量(50.55%～50.72%)相當(dāng)。從序列變異來(lái)看，18S rDNA基因序列的變異位點(diǎn)低于COI基因，說(shuō)明18S rDNA基因的進(jìn)化速率較COI基因慢，同18S rDNA基因更適合于種上階元分子分類研究的結(jié)論相一致[32-33]。

遺傳距離的大小是進(jìn)行物種鑒別的主要標(biāo)準(zhǔn)。本研究中基于COI基因丘北仙女蝦的種內(nèi)平均遺傳距離為1.1%，同Ratnasingham等[34]認(rèn)為的DNA條形碼的種內(nèi)遺傳距離<3%的一般規(guī)律相符合。此外，丘北仙女蝦與S.sirindhornae的種間遺傳距離(4.3%)相比甲殼綱同屬物種間的平均遺傳距離(15.4%)[35]，屬于種內(nèi)差異；與彎頭蟲科S.dichotomus、S.dorothae、S.texanus及釵額蟲科Thamnocephalusplatyurs的種間遺傳距離均高于甲殼綱同屬物種間的分化水平，屬于種間差異。這一結(jié)論初步表明丘北仙女蝦與S.sirindhornae屬于同一物種。而基于18S rDNA基因序列的丘北仙女蝦與S.sirindhornae的種間遺傳距離(0.2%)小于丘北仙女蝦的種內(nèi)平均遺傳距離(0.3%)，且其他仙女蝦物種的種間遺傳距離較小(0.3%～3.8%)，不符合Hebert等[35]計(jì)算的甲殼綱同屬物種間的平均遺傳距離(15.4%)，未達(dá)到物種分化水平，因此無(wú)法對(duì)仙女蝦各物種進(jìn)行區(qū)分。構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示丘北仙女蝦的單倍型序列與泰國(guó)S.sirindhornae序列聚為獨(dú)立的分枝，COI樹的節(jié)點(diǎn)支持率較高(100%)，但18S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)支持率低(72%)，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)為獨(dú)立分支的結(jié)論不可靠，同理，S.texanus與S.dorothae為獨(dú)立分支的節(jié)點(diǎn)支持率為58%，其結(jié)論也不可信。因此，利用18S rDNA基因序列對(duì)仙女蝦物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，節(jié)點(diǎn)的支持率低，若要獲取準(zhǔn)確可信的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，還需考慮結(jié)合其他基因序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。

仙女蝦Streptocephalussirindhornae是在泰國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)及描述的無(wú)甲目物種，廣泛分布于泰國(guó)東北部的臨時(shí)水域，如泰國(guó)的馬哈沙拉堪養(yǎng)殖塘等[3]；該物種也被發(fā)現(xiàn)于中國(guó)西南地區(qū)的干涸水塘，如廣西壯族自治州崇左縣白頭葉猴生態(tài)公園的沼澤地、云南瀘西老干塘的臨時(shí)水塘等[28]。本研究首次應(yīng)用COI與18S rDNA基因序列片段對(duì)云南丘北仙女蝦進(jìn)行相似性比對(duì)、遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果一致支持所測(cè)仙女蝦樣本為彎頭蟲科的Streptocephalussirindhornae。這一鑒定結(jié)果同泰國(guó)、云南瀘西發(fā)現(xiàn)及描述的S.sirindhornae應(yīng)屬于同一物種。該結(jié)論說(shuō)明了中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所舒樹森等通過(guò)形態(tài)鑒定，該物種不屬于釵額蟲科、枝額蟲屬、枝額蟲的報(bào)道相符合。同時(shí)也推測(cè)國(guó)外專家鑒定為旋額蟲科、旋額蟲屬、旋額蟲的相關(guān)報(bào)道是錯(cuò)誤的。但由于本研究?jī)H利用了COI與18S rDNA基因片段對(duì)仙女蝦物種進(jìn)行了分子鑒定，初步證實(shí)COI基因能對(duì)仙女蝦物種進(jìn)行有效鑒定，18S rDNA基因?qū)ζ滂b定存在不足，且目前難以收集到近緣的仙女蝦物種開展比較形態(tài)學(xué)研究。鑒于此，為獲取更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)論，還需結(jié)合其他核基因或基因組標(biāo)記，盡可能收集其他仙女蝦物種，并與形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合作進(jìn)一步分析。

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