抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)和活性研究

胡 莉, 王小紅

(1. 黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 駐馬店 463000; 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院, 武漢 430070)

黃曲霉毒素( Aflatoxins，AFs)是一類主要由黃曲霉、寄生曲霉等真菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的總稱，這類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本類似，均含有二呋喃環(huán)和香豆素，前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)。目前已經(jīng)分離鑒定出的有將近20種，主要分子型式有B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強(qiáng)，研究最為透徹，也是最具代表性的一種毒素[1]。1993年，AFB1被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(international agency for research center，IARC)劃為I類致癌物質(zhì)[2-3]，與乙型肝炎病毒一起成為肝癌的兩大誘因[4-5]。然而，食品中的黃曲霉污染非常常見，從農(nóng)作物的生產(chǎn)到轉(zhuǎn)化為食物、從食物鏈的低端到頂端，AFB1都有可能造成淀粉類食品、肉類食品、蛋、奶類食品以及動(dòng)物飼料等的連鎖污染，除此之外，AFB1還可通過皮膚接觸、飲食攝入等一些方式進(jìn)入人和動(dòng)物的機(jī)體。因此，對(duì)食品中黃曲霉毒素定量檢測(cè)變成一項(xiàng)很重要的工作[6]。目前的檢測(cè)方法主要有儀器法和酶聯(lián)免疫吸附法[7-8]，但前者耗時(shí)、耗力且成本較高、工序繁瑣。目前常采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，然而，該法需要高質(zhì)量的抗體，因此，獲得高質(zhì)量的抗AFB1scFv是上述研究方法的保證。scFv作為小分子功能性抗體，具有多種低成本的表達(dá)方式[9-11]，目前這種重組抗體已經(jīng)獲得許多研究學(xué)者的關(guān)注[12]。

外源蛋白采用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，能夠有效避免在原核表達(dá)系統(tǒng)中的不足，表達(dá)的外源蛋白能得到較為完整的加工修飾，其構(gòu)象與天然蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)模式也較為接近，相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的生物活性也較高，因此，真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白越來越受到研究者們的青睞[13]。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，可以將甲醇作為碳源使用，因此也叫甲醇營養(yǎng)型表達(dá)系統(tǒng)。其內(nèi)有編碼醇氧化酶的AOX1 基因，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源耗盡時(shí)，加入甲醇，AOX1基因會(huì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄醇氧化酶物質(zhì)，該物質(zhì)可以將甲醇轉(zhuǎn)化為醛類物質(zhì)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成酵母生長所需要的能量[14]。其次AOX1是強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠多次有效啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)，使得誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)時(shí)，具有較高的效率和蛋白表達(dá)量[15]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低、繁殖速度快和易于高密度生產(chǎn)發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)使得它的應(yīng)用極為廣闊[16-17]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體的分泌表達(dá)并進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

AFB1購于瑞士Alexis公司；畢赤酵母GS115菌株、表達(dá)載體pPICZαA、pET-30a、pET-22b及E.coli菌株Trans5α均為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存；AFB1-O-OVA實(shí)驗(yàn)室自制； EasyTaq酶、 Trans5K Plus DNA Marker、Trans2K Plus DNA Marker購于中國北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA 親和層析填料、ECL 顯色液、Page RulerPrestained Protein Ladder購于美國Thermo公司；雜交瘤細(xì)胞株2C10由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存；YNB、Zeocin購自Invitrogen公司；質(zhì)粒小提、DNA 凝膠回收試劑盒購于杭州AxyGen；所用引物的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；羊抗小鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗購于中國華美生物工程公司； DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、dNTP、 PMD19-T Simple Vector 購自TaKaRa公司； DNA凝膠回收純化試劑盒由中國北京莊盟國際生物基因科技有限公司提供；質(zhì)粒提取試劑盒購于中國北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增

以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建的重組載體pMD19-T-VH-2C10和pMD19-T-VL-2C10分別為模板，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得scFv-2C10片段，并在目的基因兩端分別引入XbalⅠ(NcoⅠ)和EcoRⅠ(XhoⅠ)酶切位點(diǎn)，其次，考慮到后續(xù)的純化工作，在引物設(shè)計(jì)時(shí)特別引入histag 標(biāo)簽，其具有可以特異性的結(jié)合鎳離子的功能，方便重組蛋白的純化和回收。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下所示:

引物1:CATGTCTAGA(CCATGG)CGGAGGTGAAGCTGGTGGAG [劃線處為酶切位點(diǎn)XbalⅠ(NcoⅠ)]

引物2:GCCACCGCCGGATCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT(劃線處為部分linker序列)

引物3: GGCGGTGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAA(劃線處為部分linker序列)

引物4: CCGGAATTC(CTAGAG)TTAGTGGTGATGGTGATGATGCTTGGGCTGACCTAGGACAGT(劃線處為酶切位點(diǎn)EcoRⅠ(XhoⅠ)，波浪線為histag 標(biāo)簽)

首先，以引物1和引物2為引物，PCR擴(kuò)增出帶有部分Linker的VH-Linker片段；以引物3和引物4為引物，PCR擴(kuò)增出帶有部分Linker的Linker-VL片段。PCR 擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。每輪PCR后，將3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混勻，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并借助凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物VH-Linker和Linker-VL。然后，通過重疊延伸PCR法(gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)構(gòu)建scFv-2C10基因，SOE-PCR分兩步：第一步，以上述回收的產(chǎn)物VH-Linker和Linker-VL為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，將VH 和VL 通過Linker連接合成一條單鏈。PCR擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。經(jīng)0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR產(chǎn)物。第二步，以第一步純化產(chǎn)物為模板，以引物1和引物4為引物，PCR擴(kuò)增scFv-2C10基因。PCR 擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR產(chǎn)物scFv-2C10。根據(jù)所用引物的不同，最后獲得兩種不同的PCR產(chǎn)物，即為NcoⅠ-scFv-2C10-XhoⅠ和XbalⅠ-scFv-2C10-EcoRⅠ。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的構(gòu)建和鑒定

pelB信號(hào)肽可以引導(dǎo)蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，為了方便后續(xù)的蛋白純化工作，現(xiàn)將pET-22b載體上的pelB信號(hào)肽序列克隆到最終使用載體pET-30a上，方法分為兩步，首先將“1.2.1” 中第二步獲得的PCR產(chǎn)物NcoⅠ-scFv-2C10-XhoⅠ和質(zhì)粒pET-22b均采用限制性內(nèi)切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，純化回收產(chǎn)物后，采用DNA連接酶將scFv-2C10和pET-22b進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pET-22b-scFv-2C10，并轉(zhuǎn)化E.coliTrans5α細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

然后提取上述陽性克隆子pET-22b-scFv-2C10的質(zhì)粒，純化后將重組質(zhì)粒pET-22b-scFv-2C10和質(zhì)粒pET-30a分別用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，純化回收產(chǎn)物后，采用DNA連接酶將pelB-scFv-2C10和pET-30a進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv-2C10，并轉(zhuǎn)化E.coliTrans5α細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，選取陽性轉(zhuǎn)化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測(cè)序。

測(cè)序正確的陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后，將空載體pET-30a和所提取質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取菌落轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性轉(zhuǎn)化子分別命名為BL21(DE3)-pET-30a和BL21(DE3)- pET-30a-pelB-scFv-2C10。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的表達(dá)及鑒定

無菌條件下挑取1.2.3中轉(zhuǎn)化成功的單菌落轉(zhuǎn)化子BL21(DE3)-pET-30a和BL21(DE3)- pET-30a-pelB-scFv-2C10，分別培養(yǎng)于100 mL液體LB培養(yǎng)基中(含有100 μL 的50 mg/mL的kana)，于200 r/min 、37℃條件下培養(yǎng)至OD600為0.8左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并使其終濃度為1 mmol/L、16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h，多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)時(shí)間為20 h時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。收集菌體，進(jìn)行蛋白預(yù)表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。

由于pelB信號(hào)肽的存在，所以基本確定目的蛋白主要存在于細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)。又由于只有當(dāng)新生肽鏈的合成速率大于蛋白折疊速率時(shí)，蛋白才會(huì)以包涵體的形式存在，而肽鏈的合成速率又與溫度有著直接的關(guān)系，所以我們選擇16℃低溫誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)可以有效地避免包涵體形式的形成，且實(shí)驗(yàn)證明的確如此。

采用SDS-PAGE對(duì)scFv-2C10的預(yù)表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證分析，將破碎后的菌體細(xì)胞4℃低溫離心，可溶性蛋白經(jīng)鎳柱親和層析法進(jìn)行蛋白純化，純化后的蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸6 min直接上樣，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證后，接著轉(zhuǎn)印PVDF膜，再以5%牛奶封阻PVDF膜，最后采用羊抗小鼠IgG-HRP 酶標(biāo)二抗孵育后，利用ECL顯色液顯色，觀察結(jié)果。

1.2.4 重組質(zhì)粒pPICZαA-scFv的構(gòu)建和鑒定

將“1.2.1” 中第二步獲得的PCR產(chǎn)物XbalⅠ-scFv-2C10-EcoRⅠ和質(zhì)粒pPICZαA均采用限制性內(nèi)切核酸酶XbalⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，純化回收產(chǎn)物后，采用DNA連接酶將scFv-2C10和pPICZαA進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-scFv-2C10，并轉(zhuǎn)化E.coliTrans5α細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，選取陽性轉(zhuǎn)化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞制備

1)挑取畢赤酵母GS115單菌落于5 mL液體YPD 培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min活化培養(yǎng)16 h;

2)將活化好的1 mL 菌液轉(zhuǎn)接于100 mL的液體YPD培養(yǎng)基中，28℃、2000 r/min 培養(yǎng)至OD600約于1.2時(shí)，將菌體轉(zhuǎn)入45 mL的離心管中、4200 r/min、4℃離心5 min；

3)棄上清，菌體沉淀用冰冷的無菌蒸餾水重懸，4200 r/min、4℃離心5 min；

4)棄上清，重復(fù)(3)1次；

5)棄上清，菌體用1 mol/L冰冷的無菌山梨醇重懸，4200 r/min、4℃離心5 min；

6)棄上清，重復(fù)(5)1次；

7)棄上清，菌體用1 mol/L冰冷的無菌山梨醇重懸，分裝成80 μL/管，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10質(zhì)粒的線性化

對(duì)空載E.coliTrans5a-pPiczαA菌株和測(cè)序正確的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，用限制性內(nèi)切酶BstXⅠ對(duì)質(zhì)粒E.coliTrans5a-pPiczαA、E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10進(jìn)行線性化酶切，45℃條件下，酶切20 h。以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切結(jié)果，然后回收酶切線性產(chǎn)物E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)回收效果。

1.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母及鑒定

將1.2.3中保存的感受態(tài)細(xì)胞80 μL和10 μg回收的線性化質(zhì)粒(E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10)分別進(jìn)行混勻后，一起加入已經(jīng)預(yù)冷30 min的電轉(zhuǎn)杯中(0.2 cm)，冰上靜置5 min；將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至Fungi 檔，2000 V進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)產(chǎn)物迅速加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L無菌山梨醇混勻，將混合產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到2 mL的EP管中，28℃，200 r/min 孵育2 h；取孵育好的產(chǎn)物200 μL 輕輕涂在固體YPD平板(含有100 μg/mL 的博萊霉素)上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d左右，挑取菌落轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子命名為GS115-pPiczαA和GS115-pPiczαA-scFv-2C10。

1.2.8 重組酵母的表達(dá)及鑒定

無菌條件下挑取轉(zhuǎn)化成功的單菌落轉(zhuǎn)化子GS115-pPiczαA和GS115-pPiczαA-scFv-2C10分別轉(zhuǎn)到BMGY培養(yǎng)基中，于28℃條件下培養(yǎng)至OD600為4左右時(shí)，離心回收菌體并將其重懸于100 mL BMMY培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)平行組，兩組均培養(yǎng)至OD600為1.2左右，200 r/min、28℃條件下加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并且每隔24 h向培養(yǎng)基中再次添加甲醇，并使其終濃度為0.5%，第一小組誘導(dǎo)滿20 h后，收集菌體和上清，進(jìn)行蛋白預(yù)表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。通過第二小組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)滿72 h后，蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。

采用SDS-PAGE對(duì)scFv-2C10的預(yù)表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證分析。檢測(cè)結(jié)果表明，上清液中的目的蛋白幾乎不存在，而菌體中的目的蛋白要多得多。所以接著采用Western blot 對(duì)菌體目的蛋白scFv-2C10進(jìn)行驗(yàn)證分析。將破碎后的菌體細(xì)胞經(jīng)鎳柱親和層析法進(jìn)行蛋白純化，純化后的蛋白采取同1.2.3中同樣的驗(yàn)證方法進(jìn)行初步驗(yàn)證，最后采用ECL顯色液顯色，觀察并分析結(jié)果。

1.2.9 抗AFB1 scFvs-2C10的性質(zhì)分析

以20 mL PBS緩沖溶液懸浮，在冰浴條件下將細(xì)胞超聲破碎(30 min，功率105 W，2 s開啟，2 s關(guān)閉)，4℃下10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用鎳柱親和層析純化上清液，純化后所得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE初步驗(yàn)證后，再以間接競(jìng)爭 ELISA 檢測(cè)上述兩種表達(dá)載體所表達(dá)的目的蛋白抗 AFB1scFv-2C10的靈敏度，試驗(yàn)中以pET-30a和pPICZαA兩種空載體的表達(dá)為陰性對(duì)照。

用CBS緩沖液稀釋AFB1O-OVA為1 μg/mL包被96孔板過夜，PBST洗滌甩干。每孔加入200 μL封阻液，37℃靜置2 h，甩干封阻液，PBST洗滌甩干。每孔加入90 μL用PBST 稀釋的抗AFB1 scFv-2C10和10 μL以PBS 稀釋的不同濃度的AFB1 溶液(濃度分別為2、8、20、40和60 μg/mL)，37℃靜置1 h，甩干液體，PBST洗滌甩干。每孔加入100 μL 的羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗(以PBST 4000倍稀釋)，37℃靜置1 h，甩干液體，PBST洗滌甩干。每孔加底物緩沖液100 μL后，37℃靜置15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，492 nm 測(cè)吸光值。

2 結(jié)果

2.1 目的基因scFv-2C10擴(kuò)增

以質(zhì)粒pMD19-T-VH-2C10和pMD19-T-VL-2C10分別為模板，經(jīng)SOE-PCR第一步擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二步PCR獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物scFv-2C10基因。經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，大小約為750 bp，與理論值一致?；厥赵噭┖谢厥誷cFv-2C10基因片段。

2.2 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的構(gòu)建及鑒定

將pET-30a質(zhì)粒和回收產(chǎn)物pelB-scFv-2C10分別進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliTrans5α細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子，以引物1和引物4對(duì)其進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖2-A)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論預(yù)期值一致。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒構(gòu)的建成功。

圖1 scFv基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：Trans2K DNA Marker；1：scFv-2C10 gene fragments

將測(cè)序成功的陽性轉(zhuǎn)化子pET-30a-pelB-scFv和空質(zhì)粒pET-30a分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2-B)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖2含目的基因的轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig 2 PCR results of transformants containing target gene

A：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1、2為different transformants containg scFv-2C10 gene。B：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1～10為different transformants containg scFv-2C10 gene

2.3 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的表達(dá)及鑒定

挑取固體LB平板上生長的陽性菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和法純化表達(dá)蛋白，采用SDS-PAGE和Western blot 對(duì)抗AFB1scFv-2C10蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。由圖可知，SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明已成功誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白，該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為29 ku，與目的蛋白理論值一致。BCA法測(cè)定誘導(dǎo)20 h純化后目的蛋白的產(chǎn)率約為34 mg/L。

2.4 重組質(zhì)粒pPiczαA-scFv的構(gòu)建及鑒定

將pPICZαA質(zhì)粒和回收產(chǎn)物scFv-2C10分別進(jìn)行XbalⅠ和EcoRⅠ雙酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-scFv-2C10。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliTrans5α細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子，以引物1和引物4對(duì)其進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖4-A)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論預(yù)期值一致。與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功。

圖3抗AFB1 scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE和Western-blot分析Fig 3 SDS-PAGE and Western-blot analysis for expression of anti-AFB1 scFv-2C10

A：抗AFB1scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE分析;B：純化后的抗AFB1scFv-2C10的SDS-PAGE分析;C：抗AFB1scFv-2C10表達(dá)的Western-blot分析。M：Marker；1：purified scFv-2C10

線性化質(zhì)粒E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10分別與GS115感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行混勻后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，挑取3 d左右的培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖4 B)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖4 含目的基因的轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig 4 PCR results of transformants containing target gene

A：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1、2為different transformants containing scFv-2C10 gene； B：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1～10為different transformants containing scFv-2C10 gene

2.5 重組酵母的表達(dá)及鑒定

挑取YPD 平板上生長的陽性菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和法純化表達(dá)蛋白，采用SDS-PAGE和Western blot 對(duì)抗AFB1scFv-2C10蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖5。由圖可知，SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明已成功誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白，該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為29 ku，與目的蛋白理論值一致。BCA法測(cè)定誘導(dǎo)72 h后純化的目的蛋白的產(chǎn)率約為132 mg/L。

2.6 抗AFB1scFv-2C10的性質(zhì)分析

分別以間接非競(jìng)爭ELISA和間接競(jìng)爭ELISA純化后的scFv-2C10進(jìn)行分析。間接非競(jìng)爭ELISA 表明，AFB1O-OVA包被濃度為1 μg/mL，抗AFB1scFv-2C10的濃度約為0.17 mg/mL時(shí)，OD492約為1.0。在此條件下，以AFB1為競(jìng)爭抗原，進(jìn)行間接競(jìng)爭ELISA檢測(cè)不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的目的蛋白的靈敏度，并取5個(gè)點(diǎn)以繪制scFv-2C10的間接競(jìng)爭抑制曲線，由圖6可知，兩種表達(dá)系統(tǒng)得到的目的蛋白scFv-2C10的檢測(cè)靈敏度分別約為40 μg/mL和35 μg/mL，結(jié)果表明采用酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的目的蛋白scFv-2C10與AFB1的結(jié)合活性較同一種蛋白采用E.coliBL21(DE3)表達(dá)時(shí)要稍有好轉(zhuǎn)，但是仍然沒有達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

圖5 抗AFB1 scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE和Western-blot分析Fig 5 SDS-PAGE and Western-blotanalysis for the expression of anti-AFB1 scFv-2C10

A：抗AFB1 scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE和Western-blot分析；B：純化后的抗AFB1 scFv-2C10的SDS-PAGE分析；C：抗AFB1 scFv-2C10 表達(dá)的Western-blot分析。M：Marker；1：purified scFv-2C10

3 討論

基于AFB1的毒性，其檢測(cè)的極限尤為重要。目前的檢測(cè)分析方法中使用較廣的是酶聯(lián)免疫吸附法，該法以檢測(cè)快速、靈敏、樣品制備簡單等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注。在該檢測(cè)方法中，抗體是核心試劑，以實(shí)驗(yàn)室保存的抗AFB1單克隆雜交瘤細(xì)胞株為原料構(gòu)建scFv 基因。

目前，對(duì)于外源蛋白的表達(dá)，E.coli表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用較多、研究較多的，也最具有代表性的，E.coli作為AFB1scFv的表達(dá)系統(tǒng)，E.coli具有操作方便快速、實(shí)驗(yàn)周期不長、生產(chǎn)成本小等優(yōu)點(diǎn)。但其不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的翻譯后修飾( 如二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊等)，存在一定局限性。而真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾機(jī)制接近天然形式。

圖6 scFv-2C10的間接競(jìng)爭ELISA抑制曲線Fig 6 IC-ELISA inhibition curves of pET-30a-pelB-scFv (A) and pPICZαA-scFv (B)

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)又稱甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，是因?yàn)楫叧嘟湍钢械拇佳趸窤OX1基因，在當(dāng)甲醇作為碳源時(shí)，醇氧化酶可以將甲醇轉(zhuǎn)化為醛類物質(zhì)，進(jìn)而再在其他酶類的作用下，轉(zhuǎn)化成酵母所需要的能量，以供酵母細(xì)胞的生長繁殖。當(dāng)線性化的重組質(zhì)粒在5′AOX1和3′AOX1之間和宿主菌的基因組發(fā)生同源重組時(shí)，就成功地獲得了整合基因組的轉(zhuǎn)化子?？刂拼佳趸皋D(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(PAOX1)是強(qiáng)啟動(dòng)子，當(dāng)培養(yǎng)液中加入甲醇時(shí)，PAOX1可以更高效啟動(dòng)醇氧化酶的轉(zhuǎn)錄，而目的基因也正好處于其中，所以畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白的產(chǎn)量較高。又由于它是真核表達(dá)系統(tǒng)，所以外源蛋白在構(gòu)象上折疊的更成熟。

pelB信號(hào)肽可以引導(dǎo)目的蛋白在細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)表達(dá)，并且采取一定的手段可以避免包涵體的形成，增加可溶蛋白的表達(dá)，提高純化效率[18]?；诖?，實(shí)驗(yàn)先將目的基因克隆到帶有pelB信號(hào)肽的載體pET-22b上，再將pET-22b上的pelB信號(hào)肽序列和目的基因序列一同克隆到載體pET-30a上，這樣是為了充分利用pelB信號(hào)肽的上述特性?；诖耍瑢?shí)驗(yàn)還將目的基因采用了畢赤酵母表達(dá)體系進(jìn)行蛋白表達(dá)以與E.coli表達(dá)體系相比較。最終本研究成功構(gòu)建了兩種重組載體pET-30a-pelB-scFv-2C10和pPiczαA-scFv，并將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)，以期望scFv的親和力和蛋白表達(dá)量能有所提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得的目的蛋白的最高表達(dá)量132 mg/L是E.coli表達(dá)系統(tǒng)中蛋白最高表達(dá)量的4倍。經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種表達(dá)系統(tǒng)得到的目的蛋白scFv-2C10均顯示出較好的活性，經(jīng)檢測(cè)，靈敏度分別約為40 μg/mL和35 μg/mL，這說明在酵母表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的活性得到了一定的提高，原因可能是scFv得到了較為充分的折疊和翻譯后修飾。但是距離預(yù)期目標(biāo)仍有較大的差距，接下來的實(shí)驗(yàn)還需要大量的分析和改進(jìn)，分析其原因可能是因?yàn)閟cFv的自身編碼基因的親和力不夠高，所以在未來的實(shí)驗(yàn)中，可能會(huì)采取基因工程技術(shù)手段，如基因定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變等對(duì)scFv的親和力進(jìn)行提高。

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