輻照對長江可培養(yǎng)微生物的影響及挑選指示微生物

宋家斑, 蒯琳萍

(上海交通大學(xué)核科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200240)

0 引言

近年來,內(nèi)陸核電建設(shè)已成為我國能源戰(zhàn)略中一項重要的議程[1]. 但與濱海核電站相比,內(nèi)陸核電站受納水體容積較小,一旦發(fā)生泄漏事故,對當(dāng)?shù)鼐用竦纳a(chǎn)、 生活將產(chǎn)生極大影響,因此,內(nèi)陸核電站低放廢水排放標(biāo)準(zhǔn)比濱海核電站嚴(yán)格十倍[2]. 同時,為保證監(jiān)測可靠,內(nèi)陸核電需要更多科學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)[3]. 其中,生物監(jiān)測可作為一項重要手段,更加客觀地評價內(nèi)陸核電站在正常運(yùn)行、 事故工況以及退役過程中釋放的放射性核素對環(huán)境產(chǎn)生的影響[4].

作為自然界中數(shù)量最多、 生物量最大、 對生命元素循環(huán)具有最大影響力的種群,微生物在用作水體環(huán)境監(jiān)測上具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢[5]. 相較于高等動物和植物,低等微生物對環(huán)境中出現(xiàn)的放射性物質(zhì)、 重金屬、 有機(jī)化合物等污染會表現(xiàn)得更加敏感,它們能夠最快感受到生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)境質(zhì)量的變化,并通過相關(guān)機(jī)制做出對應(yīng)反應(yīng). 因此,微生物被認(rèn)為是最有潛力的指示生物[6].

目前,在重金屬、 農(nóng)藥等一系列污染領(lǐng)域中,將微生物作為污染指示生物的相關(guān)研究已經(jīng)取得了令人矚目的成就[7]. 但在放射性污染領(lǐng)域,尚未出現(xiàn)選用微生物進(jìn)行生物監(jiān)測的研究報道. 本研究通過對比長江水樣輻照前后可培養(yǎng)微生物出現(xiàn)的變化情況,探討輻照對微生物種群結(jié)構(gòu)的影響； 同時,尋找水體中具有指示價值的微生物,為長江流域放射性污染的生物監(jiān)測提供相關(guān)參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 水樣采集

于2016年6月1日對長江流域三個點位進(jìn)行水樣采集,采樣點位置如圖1所示. 用有機(jī)玻璃采樣器采集各點位水面之下0.5 m處的水樣,充分混合后,裝入事先經(jīng)過濕熱滅菌的塑料瓶中,放入保溫箱內(nèi),立即送往上海市計量測試技術(shù)研究院對樣品進(jìn)行輻照.

圖1 樣品采集點位示意Fig.1 Location of sampling sites

1.2 樣品輻照

樣品輻照： 采用60Co源對樣品進(jìn)行輻照,劑量分別為2、 20、 200 Gy,并取一組沒有經(jīng)過輻照的水樣作為空白對照.

1.3 分析方法

1) 樣品中細(xì)菌的計數(shù)[8]. 樣品經(jīng)稀釋后涂布在R2A瓊脂平板上,每組樣品設(shè)置3個平行對照,30 ℃培養(yǎng). 每日觀察菌落形態(tài), 進(jìn)行群落統(tǒng)計,根據(jù)菌落尺寸、 顏色、 隆起情況、 邊緣形狀來區(qū)分不同種類菌種.

2) 單菌種生理生化功能測定. 將R2A平板上培養(yǎng)得到的菌株轉(zhuǎn)接出來,純化3次,參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]對單菌種進(jìn)行生理生化功能實驗,初步鑒定其種屬信息.

3) 單菌種分子生物學(xué)鑒定. 將菌種送往上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行DNA提取、 PCR擴(kuò)增及序列測定,確定細(xì)菌種屬.

4) 群落多樣性分析[10]. 群落多樣性用豐度(S)、 優(yōu)勢度(P)、 Simpson指數(shù)(L)和Shannon-Wiener指數(shù)(H)4個群落多樣性指數(shù)表征.

(1)

(2)

(3)

其中： S表示樣品中所含的不同形態(tài)特征的菌落種類數(shù)； P表示某一類型菌種所占比例； L表示樣品中隨機(jī)挑選的兩個菌落為同一類型菌種的概率,L越小,表示種群分布越均勻,種群越豐富； H是能夠反映群落均勻度和多樣性的復(fù)合指標(biāo),H越大,則表明生物多樣性越高.

5) 相關(guān)性分析. 使用軟件OriginLab9.0對不同輻照劑量下,細(xì)菌總數(shù)及單菌種數(shù)量的改變情況進(jìn)行曲線擬合,了解輻照強(qiáng)度與菌種數(shù)量改變之間的相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌種鑒定

從水體中共分離出了18種菌落類型,分別命名為a～r. 對所有的18類菌落分別進(jìn)行生理生化實驗(見表1)及分子生物學(xué)鑒定(見表2),通過與NCBIribosomalRNAsequence數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,將序列相似度最大的菌種認(rèn)定為鑒定結(jié)果. 可以發(fā)現(xiàn)分離得到的菌落屬于多個不同種屬,其中,屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)的菌種有4種,芽孢桿菌屬(Bacillus)、 鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)以及不動桿菌屬(Acinetobacter)各2種,其余各屬各有一種.

表1 菌種生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strains

注： “+”表示陽性,“-”表示陰性

表2 菌種鑒定結(jié)果Tab.2 Bacterial identification results

2.2 輻照對微生物數(shù)量的影響

統(tǒng)計經(jīng)輻照后平板上各形態(tài)菌落的數(shù)量,各輻照強(qiáng)度下細(xì)菌的群落組成如表3所示. 可以看到,隨著輻照劑量的提高,培養(yǎng)得到的微生物數(shù)量呈現(xiàn)遞減趨勢,可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量從對照組的2.35×104CFU·mL-1降到了200 Gy輻照強(qiáng)度下的6.8×103CFU·mL-1,降幅達(dá)到71.67%,表明高強(qiáng)度的輻照會使大部分微生物失活,Krisko等[11]的實驗也得出了類似結(jié)論. 當(dāng)輻照劑量為2 Gy時,可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量為2.21×104CFU·mL-1,與對照組差異不大,表明該輻照劑量不會對微生物造成太大的影響.

表3 不同輻照強(qiáng)度下樣品中細(xì)菌的群落組成Tab.3 Flora composition of bacteria in the different irradiance samples

2.3 輻照對微生物種群結(jié)構(gòu)的影響

表4 不同輻照強(qiáng)度下樣品中的群落多樣性Tab.4 Community diversity in the different irradiance samples

由表3分析結(jié)果知,當(dāng)輻照劑量為2 Gy時,群落結(jié)構(gòu)基本沒有改變,說明該劑量的輻照對微生物影響很小,此結(jié)果與輻照對數(shù)量的影響相一致. 隨輻照強(qiáng)度的增加,可培養(yǎng)細(xì)菌種類反而增加了4種,該結(jié)果是由于輻照使得較為敏感的優(yōu)勢菌種大量死亡,其余輻照耐性較強(qiáng)的菌種獲得了足夠的生長空間所致. Simpson指數(shù)(L)隨輻照劑量的增加而下降(見表4),也印證了隨輻照強(qiáng)度增加可培

圖2 不同輻照強(qiáng)度下樣品中各菌屬比例分布Fig.2 Proportion of the genus in the different irradiance samples

養(yǎng)微生物種群變得更豐富、 種群分布變得更加均勻的結(jié)論,El-Sayed等[12]的研究中也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象. 分析樣品中各菌屬比例隨輻照強(qiáng)度的改變情況(見圖2),結(jié)果表明： 黃桿菌屬(Flavobacterium)細(xì)菌在各組中所占比例最高,是優(yōu)勢菌屬； 隨輻照強(qiáng)度的增加,黃桿菌屬(Flavobacterium)的比例從58.29%降到了29.31%,受輻照影響大； 相較而言,芽孢桿菌屬(Bacillus)的比例從對照組的3.35%上升到200 Gy組的19.12%,表明該屬細(xì)菌對輻照具有高耐受性.

2.4 輻照對單菌種的影響

菌種d(Flavobacteriumnitratireducensstrain N1)數(shù)量的變化趨勢(見圖3)與可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化趨勢(見圖4)相類似. 樣品中菌種的組成情況(見表3)表明： 隨著輻照劑量的增加,該菌種所占比例從對照組的40.43%降至200 Gy組的16.18%,且細(xì)菌總數(shù)下降了88.42%,說明該菌種的輻照敏感度高； 同時,該菌種是水體中的優(yōu)勢菌種. 因此可認(rèn)為,菌種d(Flavobacteriumnitratireducensstrain N1)有作為長江流域放射性污染指示生物的價值.

圖3 不同輻照劑量下菌種d數(shù)量的變化情況Fig.3 Variation of strain d under different irradiation doses

圖4 不同輻照劑量下可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化情況Fig.4 Variation of total bacteria under different irradiation doses

3 討論

目前,國內(nèi)外關(guān)于輻照對微生物影響的研究[13-14]中,大多選用kGy劑量進(jìn)行輻照； 而本實驗采用Gy量級進(jìn)行輻照,多數(shù)微生物也出現(xiàn)了較高的輻照致死率. 主要是由于本實驗的輻照樣本為自然水體,可培養(yǎng)微生物濃度只有2.35×104CFU·mL-1,其他實驗則是選取經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌懸液作為研究對象,可培養(yǎng)微生物濃度大致為106～107CFU·mL-1. 相關(guān)研究表明[15],初始含菌量越高,輻照對微生物產(chǎn)生的影響就越小. 此外,本實驗選用塑料容器,相比于Mahmoud等[14]使用的玻璃試管來說,塑料容器密度較小,原子序數(shù)比玻璃低,輻射的透過性較好.

微生物主要通過快速修復(fù)受損的DNA片段、 形成芽孢減緩新陳代謝速率、 產(chǎn)生超氧化物歧化酶清除自由基等途徑來降低輻照損傷. 實驗中提到的芽孢菌屬(Bacillus)細(xì)菌能在不良生存條件下通過產(chǎn)生芽孢的形式減少水分含量、 減緩代謝速度來降低輻照所造成的傷害,因此具有較強(qiáng)的輻照耐受性. 同時,Zhi[16]發(fā)現(xiàn),革蘭氏陽性菌要比革蘭氏陰性菌耐輻照； 吳江等[17]研究得出好氧微生物的超氧化物歧化酶含量要高于兼性厭氧微生物.

實驗挑選出的菌種d(Flavobacteriumnitratireducensstrain N1)屬于兼性厭氧的無芽孢革蘭氏陰性菌,所以相比其他分離菌種,它對輻照更加敏感. 同時,菌種d屬于黃桿菌屬,Cousin 等[18]總結(jié)了該菌屬的分布情況,得出該類細(xì)菌廣泛的存在于自然水體中. 因此該菌種有作為長江水體放射性污染指示生物的價值.

目前相關(guān)方向的研究主要側(cè)重于輻照對單菌種的影響,以期獲得耐輻照菌種或了解輻照產(chǎn)生的致死率等信息,如Lee等[19]對大腸桿菌、 蠟狀芽孢桿菌等菌種輻照致死劑量的研究； Rainey等[20]對耐輻照菌種的挑選. 本研究則將重點放在輻照對環(huán)境水體中可培養(yǎng)微生物的整體影響上,探究輻照引發(fā)微生物種群結(jié)構(gòu)的變化情況. 同時,尋找水體中具有指示價值的微生物,為長江流域放射性污染的生物監(jiān)測提供相關(guān)參考依據(jù).

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