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    電針長(zhǎng)強(qiáng)穴對(duì)FMR1基因敲除小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)的影響

    2018-03-08 08:34:51張志燦楊曉婷
    福建中醫(yī)藥 2018年1期
    關(guān)鍵詞:皮質(zhì)電針海馬

    張志燦,楊曉婷,林 棟

    (福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院,福建 福州 350122)

    隨著社會(huì)醫(yī)療的不斷發(fā)展,近年來出現(xiàn)了許多關(guān)于智力落后、精神發(fā)育不全或精神發(fā)育遲滯等相關(guān)研究。精神發(fā)育遲滯多數(shù)發(fā)生于嬰幼兒期,而脆性 X綜合癥(fragile x syndrome,F(xiàn)RX)是常見的遺傳性智力發(fā)育遲緩疾病,其主要癥狀是神經(jīng)突觸發(fā)育的各種異常,如樹突棘異常,突觸之間的連接對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性有重要作用[1-2]。實(shí)驗(yàn)研究表明,針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴可以改善自閉癥模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力,同時(shí)針灸治療精神發(fā)育遲滯有著較好的臨床療效[3-4]。在針灸的作用機(jī)制研究中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的可塑性的作用[5],CREB信號(hào)通路參與長(zhǎng)時(shí)程的易化,使得學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)活動(dòng)依賴性[6]。此外,CREB信號(hào)通路還參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[7]。結(jié)合課題組的前期工作,本研究采用脆性X智力低下1(fragile X mental retardation 1,F(xiàn)MR1)基因敲除小鼠,這種小鼠具有智力低下、焦慮煩躁及易被激惹的特點(diǎn)[8-9]。本論文通過觀察該小鼠的自主行為學(xué)及皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)水平,探討電針長(zhǎng)強(qiáng)穴對(duì)FMR1基因敲除小鼠皮質(zhì)功能的影響。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 FMR1基因敲除型小鼠24只,由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于19日齡對(duì)小鼠進(jìn)行剪耳、分籠、取血并鑒定基因型。本研究動(dòng)物在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按SPF級(jí)環(huán)境喂養(yǎng)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 免疫印跡一抗CREB,免疫印跡二抗 Goat Anti-Rabbit IgG(Cell Signaling Technology);BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[生工生物工程(上海)股份有限公司];顯影液(MXB Biotechnologies)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 SW-CJ-ID潔凈工作臺(tái)(蘇州江東精密儀器有限公司);DC-1020型電熱恒溫水槽(上海平軒科學(xué)儀器有限公司);DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海譜振生物科技有限公司);VE-180垂直電泳槽(上海郎賦實(shí)業(yè)有限公司);GG/D2凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司);HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司);RM2235切片機(jī)(徠卡微系統(tǒng)有限公司);ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀(上海欣曼科教設(shè)備有限公司);凝膠成像分析儀(美國(guó)BIO-RAD公司);TD4XD離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);華佗牌0.25 mm×3 mm毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 分組和干預(yù) 根據(jù)基因鑒定結(jié)果,將23日齡的小鼠隨機(jī)分為空白組、電針非穴組、電針長(zhǎng)強(qiáng)穴組各8只。選取華佗牌30號(hào)1寸毫針,長(zhǎng)強(qiáng)穴組于尾根與肛門之間的凹陷中進(jìn)針,進(jìn)針方向沿小鼠尾根部下方向前直刺,進(jìn)針深度約10 mm;電針非穴組于肋弓最低點(diǎn)上1 cm進(jìn)針。2組均采用韓氏電針儀連接針灸針,刺激參數(shù)為2 Hz頻率,連續(xù)波,強(qiáng)度為1~3 mA,以小鼠局部肌肉輕微抖動(dòng)且無明顯掙扎為度,持續(xù)時(shí)間20 min,進(jìn)針及留針期間將小鼠以黑布蒙頭,以雙手適度束縛??瞻捉M除模擬針刺過程中的抓取動(dòng)作外,不進(jìn)行其他操作。各組小鼠均連續(xù)干預(yù)14 d,于第15 d取材。

    2.2 自主行為學(xué)檢測(cè) 分別于干預(yù)前2天(T1)、干預(yù)結(jié)束前2天(T2)進(jìn)行自主行為學(xué)檢測(cè)。將3組小鼠依次放入自主活動(dòng)測(cè)試儀中,適應(yīng)環(huán)境5 min后開始啟動(dòng)機(jī)器,時(shí)間為10 min,檢測(cè)后記錄活動(dòng)數(shù)及清算黑格里的糞便數(shù)。

    2.3 皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá) 取出FMR1基因敲除型小鼠的皮質(zhì)腦區(qū),采用Western blot印跡法檢測(cè)CREB蛋白表達(dá)水平,用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)Chemi Imager 5500V2.03軟件進(jìn)行掃描,用Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析測(cè)得IDV值(integrated density value)。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以()表示,采用單因素方差分析。

    3 結(jié)果

    3.1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較 見表1。

    表1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較()

    表1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較()

    注:與空白組比較,1) P<0.05;與電針非穴組比較,2) P<0.05。

    組別空白組電針非穴組電針長(zhǎng)強(qiáng)穴組n 8 8 8 T1 124.00±12.00 129.00±10.00 129.00±13.00活動(dòng)量/次 糞便數(shù)/個(gè)T2 124.00±6.00 138.00±8.00 156.00±13.001)2)T1 4.38±1.60 4.44±1.27 4.19±1.07 T2 4.25±1.46 4.56±0.94 5.19±1.33

    3.2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)的比較 見圖 2、表 2。

    圖2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白電泳圖

    表2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)比較()

    表2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)比較()

    注:與空白組比較,1) P<0.05;與電針非穴組比較,2) P<0.05。

    CREB/β-actin 1.82±1.90 2.41±1.85 5.76±3.511)2)組別空白組電針非穴組電針長(zhǎng)強(qiáng)穴組n 8 8 8

    4 討論

    《靈樞》記載:“督脈之別,名曰長(zhǎng)強(qiáng)……入貫?zāi)o,實(shí)則脊強(qiáng),虛則頭痛?!保?0]古人以長(zhǎng)強(qiáng)穴作為治療腦部疾病的重要穴位。在臨床研究中發(fā)現(xiàn),針灸長(zhǎng)強(qiáng)穴能在一定程度上改善精神發(fā)育遲滯兒童的學(xué)習(xí)記憶能力。目前,長(zhǎng)強(qiáng)穴已經(jīng)被作為治療精神發(fā)育遲滯、抑郁癥等認(rèn)知障礙疾病的治療要穴。有研究顯示電針能促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù),改善認(rèn)知障礙,增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力[11]。也有研究顯示電針承山與長(zhǎng)強(qiáng)能起到一定的鎮(zhèn)痛作用,可能與神經(jīng)修復(fù)有關(guān)[12]。因此本研究探討電針長(zhǎng)強(qiáng)穴對(duì)FMR1基因敲除小鼠自主行為學(xué)及CREB蛋白的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,干預(yù)后電針長(zhǎng)強(qiáng)組較其他組活動(dòng)數(shù)明顯增加,同時(shí)電針長(zhǎng)強(qiáng)穴的FMR1基因敲除小鼠CREB蛋白表達(dá)增強(qiáng),提示電針FMR1基因敲除小鼠的長(zhǎng)強(qiáng)穴在某種程度上能夠提高小鼠皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的興奮性而表現(xiàn)為活動(dòng)數(shù)增加,而這一效應(yīng)則有可能通過對(duì)CREB蛋白表達(dá)的提高得以實(shí)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)電針改善AD小鼠重新恢復(fù)突觸功能,最終提高AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[13-16]。而突觸的連接能夠影響反射的感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,其中CREB磷酸化對(duì)長(zhǎng)時(shí)程易化過程起到至關(guān)重要的作用。因此,CREB蛋白表達(dá)的提高,對(duì)神經(jīng)元的應(yīng)激及再生有著關(guān)鍵的作用,并有可能通過與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等相關(guān)信號(hào)分子的相互作用,對(duì)精神發(fā)育遲滯等疾病發(fā)揮作用。

    綜上所述,電針長(zhǎng)強(qiáng)穴可以增加FMR1基因敲除小鼠的活動(dòng)量及其皮質(zhì)CREB蛋白的表達(dá)量,為我們后續(xù)開展針刺FMR1基因敲除小鼠長(zhǎng)強(qiáng)穴對(duì)損傷神經(jīng)元影響的機(jī)制探索提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    [1] 吳強(qiáng),陳麗云,張學(xué)君.X染色體上脆性X智力低下基因1敲除模型小鼠針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴學(xué)習(xí)記憶及海馬CA1區(qū)γ-氨基丁酸A型受體α1亞基表達(dá)的影響[J].中國(guó)組織工程研究,2015,19(49):7964-7968.

    [2] 韓平,俞萍,陳可愛,等.針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴對(duì)FMR1基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)BDNF和SYN表達(dá)的影響[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,22(5):14-18.

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    [4] 張晨驥,張學(xué)君,陳蘭芳,等.電針“長(zhǎng)強(qiáng)”穴對(duì)FMR1基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)NLGN-3蛋白表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2017,44(4):858-861.

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