栝樓桂枝湯對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)的影響

陳喆鳴，南麗紅，謝晴晴，黃 枚

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

腦缺血再灌注損傷是腦缺血疾病中常見(jiàn)的現(xiàn)象，其病理生理過(guò)程十分復(fù)雜，主要包括氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、Ca2＋超載等，最終引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡乃至壞死。近年來(lái)研究已證實(shí)腦缺血再灌注損傷引起的活性氧蓄積和細(xì)胞內(nèi)Ca2＋紊亂極易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這可能是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。因此，ERS成為三大調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。栝樓桂枝湯出自《金匱要略》，已有研究表明栝樓桂枝湯具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗興奮性氨基酸毒性的作用［2-3］，而課題組前期研究亦表明栝樓桂枝湯通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用，減少腦梗死體積［4-5］，具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用［6］，但其作用是否與ERS相關(guān)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以ERS為切入點(diǎn)，觀察栝樓桂枝湯對(duì)ERS關(guān)鍵蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78 （glucosere-gulatedprotein，GRP78）、轉(zhuǎn)錄活化因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）、C／EBP 同源蛋白（C／EBP homology protein，CHOP）及其下游細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell leukemia／lymphoma gene number 2，Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）mRNA 表達(dá)的影響，為其促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能康復(fù)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（270±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 大棗（北京同仁堂健康藥業(yè)福州有限公司，批號(hào)：20150910）；甘草（福州回春中藥飲片廠有限公司，批號(hào)：15060901）；桂枝（亳州市永剛飲片廠有限公司，批號(hào)：160113）；天花粉（北京同仁堂健康藥業(yè)福州有限公司，批號(hào)：20151202）；白芍（北京同仁堂健康藥業(yè)福州有限公司，批號(hào)：20151123），生姜（福建承創(chuàng)堂藥店）；尼莫地平（山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司，批號(hào)：150601）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQTMSYBR?Color qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）；氯仿（衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司）；異丙醇（廣東省化學(xué)式工程技術(shù)開(kāi)發(fā)研究中心）；無(wú)水乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó) Applied Biosystems公司）；PrimoR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) Thermo Fisher公司）；C1000TMThermal Cycler PCR儀（美國(guó)Bio-rad公司）。

1.5 PCR引物 PCR引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司參照Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)合成并驗(yàn)證。GRP78：上游 5'-GACCTGGTTCTGCTTGATGTG-3'，下游5'-TCGTTCACCTTCGTAGACCTT-3'；ATF4：上游 5'-GCCTGACTCTGCTGCTTATATTAC-3'，下游 5'-CGA GAACCACGAGGAACAC-3'；CHOP：上游 5'-CCTCG CTCTCCAGATTCCA-3'，下游 5'-CTCCTGCTCCTTC TCCTTCA-3'；Bcl-2：上游 5'-GATGACTTCTCTCGT CGCTACCGT-3'，下游 5'-GGAGAAATCAAACAGA GGTCGCAT-3'；Caspase-3：上游 5'-ACGGCAAGTT CAACGGCACAG-3'，下游 5'-TGTGAACTTGGTTGG CTTGT-3'；GAPDH：上游 5'-CAACGGGAAACCCA TCACCA-3'，下游 5'-ACGCCAGTAGACTCCACGAC AT-3'。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 栝樓桂枝湯的制備 稱取2個(gè)處方量的藥材：栝樓根 60 g，桂枝 18 g，白芍 18 g，大棗 18 g，生姜18 g，甘草12 g，將藥材初步粉碎，置于圓底燒瓶中，加入10倍量的超純水浸泡30 min后回流提取，共2次，每次1.5 h。紗布過(guò)濾后，合并濾液。將藥液濃縮到100 mL至實(shí)驗(yàn)所需濃度1.44 g／mL。

2.2 分組、造模與干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和造模組，造模組建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，具體操作：將大鼠按60 mg／kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，頸部皮膚消毒后切開(kāi)，鈍性分離左側(cè)胸鎖乳突肌，暴露大鼠頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈；用縫合線于近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈血流；于頸總動(dòng)脈剪一切口，往頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入線栓，栓塞2 h后拔出。假手術(shù)組除不插入線栓外其余操作相同。待動(dòng)物完全蘇醒后進(jìn)行Longa神經(jīng)功能評(píng)分［7］，神經(jīng)功能評(píng)分3～4分視為造模成功，評(píng)分過(guò)程至少由2人同時(shí)進(jìn)行。

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。于造模當(dāng)日待大鼠完全清醒后，低、中、高劑量組分別予栝樓桂枝湯按 3.6、7.2、14.4 g／（kg·d）灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予尼莫地平混懸液按 1.05 g／（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)7 d。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分 采用Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分法［7］對(duì)干預(yù)7 d后6組大鼠進(jìn)行評(píng)分。大鼠神經(jīng)功能無(wú)缺陷，記0分；缺血側(cè)對(duì)側(cè)前肢無(wú)法伸展，記1分；缺血側(cè)對(duì)側(cè)前肢屈曲，記2分；大鼠輕度向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，記3分；若嚴(yán)重轉(zhuǎn)圈，記4分；大鼠向缺血側(cè)對(duì)側(cè)偏癱，記5分。

2.3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子基因表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)大鼠皮質(zhì) GRP78、ATF4、CHOP、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況。使用Trizol法提取大腦皮質(zhì)總RNA，參照試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)指標(biāo)基因的表達(dá)。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中 Mix 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模版 DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 95 ℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s后退火至60℃變性30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熔解曲線以機(jī)器本身默認(rèn)程序獲得。本研究選用GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組樣品的2－△△Ct值并進(jìn)行歸一化處理。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，方差齊者采用單因素方差分析LSD檢驗(yàn)法，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法；等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 6組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較（） 分

表1 6組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較（） 分

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組n 14 14 14 14 14 14神經(jīng)功能損傷評(píng)分0 2.86±0.771）1.43±0.512）2.29±0.473）1.64±0.632）1.50±0.522）

3.2 6組大鼠皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達(dá)比較（n＝6，）

表2 6組大鼠皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達(dá)比較（n＝6，）

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組GRP78 1.04±0.27 2.10±0.191）1.14±0.233）1.72±0.143）1.41±0.223）1.01±0.093）ATF4 1.01±0.12 2.29±0.361）1.24±0.163）1.44±0.193）1.49±0.243）1.54±0.223）CHOP 1.06±0.34 1.90±0.331）1.20±0.203）1.41±0.244）1.04±0.393）1.11±0.233）Bcl-2 1.05±0.35 0.52±0.212）0.90±0.114）0.81±0.134）0.91±0.164）0.83±0.164）Caspase-3 1.02±0.20 1.90±0.121）1.16±0.113）1.48±0.093）1.30±0.143）1.23±0.083）

4 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由內(nèi)膜構(gòu)成的封閉網(wǎng)狀細(xì)胞器，是真核細(xì)胞中Ca2＋貯存和蛋白質(zhì)合成、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場(chǎng)所，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正常生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的變化十分敏感。ERS是由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞后引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，其與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切。最初，Petito等［9］通過(guò)電鏡發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)改變并伴有遲發(fā)性神經(jīng)元死亡；Paschen［10］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞具有發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且腦缺血后出現(xiàn)ERS，提示ERS參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。隨后的研究指出腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞容易引起蛋白合成受阻，大量未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。 UPR 是介導(dǎo) ERS最重要的信號(hào)機(jī)制，其在ERS初期對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)具有積極的意義，但持續(xù)的應(yīng)激將會(huì)激活下游的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，引起細(xì)胞凋亡［11］。

GRP78與CHOP是ERS的特征性指標(biāo)，二者的病理性表達(dá)水平升高預(yù)示著ERS的發(fā)生以及由其介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的激活［12］。在正常生理狀態(tài)下，GRP78與相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白以復(fù)合物的形式存在，抑制ERS的激活；但當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，GRP78將會(huì)解離并大量表達(dá)，促使ATF4轉(zhuǎn)錄、翻譯并發(fā)生轉(zhuǎn)位，進(jìn)而上調(diào)CHOP表達(dá)水平［13-14］。CHOP是ERS和細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是ERS特異性的中間信號(hào)分子。其在正常生理狀態(tài)下表達(dá)水平較低，但當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)CHOP的表達(dá)水平將會(huì)升高，并抑制下游Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Caspase-3的釋放以及Caspase依賴性凋亡途徑的激活［15］。

本研究結(jié)果顯示，栝樓桂枝湯可明顯減輕MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能癥狀，這與前期的研究結(jié)果相一致［4］。本研究經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MCAO模型大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)中 GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯增多，而B(niǎo)cl-2 mRNA的表達(dá)明顯減少，提示腦缺血再灌注損傷后ERS的啟動(dòng)以及其下游細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活。栝樓桂枝湯治療后可明顯下調(diào) GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)，提示栝樓桂枝湯可顯著下調(diào)ERS水平，抑制下游凋亡通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮治療作用。mRNA是蛋白翻譯的模板，基因的表達(dá)是蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)和前提。本研究由于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)所限，目前雖只檢測(cè)基因表達(dá)，但為今后進(jìn)一步研究上述基因及其上下游蛋白的表達(dá)提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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