電針后血清對脂多糖誘導的軟骨細胞IL-1β、IL-6表達的影響

陳后煌 ，李西海，李 俐 ，吳追樂，鄭春松 ，徐 欣，洪秀娥 ，吳明霞

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以軟骨退變、軟骨下骨重建失衡以及骨贅形成為主要特征的慢性骨關節(jié)疾病，病情反復，纏綿難愈［1-2］。作為軟骨中唯一的細胞類型，軟骨細胞對維持軟骨的完整性及軟骨的負重功能具有重要作用，軟骨細胞功能改變是引起OA的重要因素。軟骨退變的發(fā)病機制尚未完全闡明，但已有研究表明：炎癥因子對骨關節(jié)炎軟骨退變進程發(fā)揮重要調(diào)控作用［3-4］。電針具有舒筋通絡、消腫止痛、補腎益精等作用，其特點為多層面、多途徑、多靶點治療，經(jīng)過中樞的整合可有效調(diào)控機體的免疫應答以及細胞的增殖、分化及凋亡，從而減輕患者的臨床癥狀［5-7］。電針能夠有效改善關節(jié)軟骨的炎性癥狀［8］，但其具體機制不甚明了。為探討電針的作用機制，本實驗采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導建立SD大鼠體外軟骨細胞炎癥模型，觀察電針后血清對軟骨細胞炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 華佗牌SD-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；華佗牌一次性不銹毫針，規(guī)格：15 mm×0.25 mm（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；IX70倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；LX-800酶標儀（美國BIO-TEK公司）。

1.2 實驗動物 2月齡和4周齡清潔級雄性SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［合格證號：SCXK（滬）2012－0002］。 處理實驗動物依據(jù)《關于善待實驗動物的指導性意見》［9］。

1.3 實驗藥物 LPS購自美國sigma公司，用PBS緩沖液溶解，配置成10 μg／mL母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗方法

1.4.1 電針后血清的制備 2月齡雄性SD大鼠40 只，隨機分為空白組（n＝10）和造模組（n＝30）。造模組采用改良 Hulth造模法復制膝骨關節(jié)炎模型，模型成功的判定標準參考文獻［10］，術后4周，將造模成功的造模組大鼠隨機分為對照組、實驗1組和實驗2組各10只。

實驗組大鼠取雙側(cè)膝關節(jié)內(nèi)、外膝眼，采用15 mm×0.25 mm毫針垂直刺入4 mm，調(diào)整電子針療儀脈沖頻率2 Hz，輸出脈沖強度2 mA，每周治療5 d，休息2 d，共治療12周。實驗1組每天電針治療15 min，實驗2組每天電針治療30 min，空白組和對照組正常飼養(yǎng)。治療時間按人和動物藥物等效劑量換算：給藥劑量＝臨床常用量×動物等效面積系數(shù)，確定電針干預時間為15 min等效于臨床30 min 的治療時間［11－12］。 療程結(jié)束后，水合氯醛麻醉，腹主動脈采集血液，制備實驗用血清。

1.4.2 軟骨細胞的分離、培養(yǎng) 4周齡SD大鼠10只脫頸處死，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下分離雙膝關節(jié)，切取關節(jié)表面軟骨，修剪去除肌肉、骨膜和軟骨下骨，以不滲血為度；切取軟骨，置于無菌培養(yǎng)皿，用PBS緩沖液沖洗關節(jié)軟骨3次，沖洗后加入2.5 g／L胰蛋白酶，37℃培養(yǎng)箱消化20 min，終止消化；置入盛有0.2%Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)皿，放于37℃培養(yǎng)箱中，每45 min取上清，用200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1000 r／min離心 5 min，收集軟骨細胞，并換消化液繼續(xù)進行消化，重復4次。用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL、鏈霉素 100 μg／mL）重懸軟骨細胞，調(diào)整軟骨細胞懸液濃度為（2～3）×105／mL，接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，每2 d更換培養(yǎng)液1次，倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞長滿至80%后傳代培養(yǎng)，此為原代軟骨細胞，待細胞長滿至培養(yǎng)瓶底90%左右時，可再次傳代培養(yǎng)［13］。

1.4.3 軟骨細胞分組和干預 第2代軟骨細胞以1×105／mL密度接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗，將細胞分為正常組、模型組、電針15 min組和電針30 min組。正常組加入含10%空白組血清的培養(yǎng)液；模型組加入含10%空白組血清、10 ng／mL LPS的培養(yǎng)液；電針15 min組加入含實驗1組血清、10 ng／mL LPS的培養(yǎng)液；電針30 min組加入含實驗2組血清，10 ng／mL LPS的培養(yǎng)液。干預8 h后，ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6 的含量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料屬正態(tài)分布以（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 軟骨細胞形態(tài)學觀察 原代軟骨細胞早期多呈多角形或三角形，1～3個核仁，大小和致密程度不等；培養(yǎng)3 d后可見軟骨細胞逐漸增大，胞核與核仁也逐漸清晰（圖1A）。第1代軟骨細胞，以圓形或橢圓形為主，培養(yǎng)3 d可見細胞融合，出現(xiàn)成簇生長現(xiàn)象（圖1B）。第2代軟骨細胞增殖速度較快，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，呈星形、多邊形，胞漿豐富，胞核清晰，可見1～2個核仁，逐漸融合為單層，呈不規(guī)則“鋪路石”樣（圖1C）。第3代軟骨細胞增殖速度相對減慢，多出現(xiàn)脂肪粒樣“老化”現(xiàn)象（圖1D）。

圖1 軟骨細胞形態(tài)圖（×200）

2.2 軟骨細胞的Ⅱ型膠原免疫組化鑒定 Ⅱ型膠原免疫組化染色可見陽性細胞的胞漿呈棕黃色（圖2A），未見棕黃色為陰性細胞（圖2B）。

2.3 4組軟骨細胞干預后IL-1β、IL-6表達變化比較 見圖3。

3 討論

3.1 軟骨細胞的培養(yǎng)鑒定 軟骨退變是骨關節(jié)炎的主要病理特征，表現(xiàn)為軟骨細胞、軟骨基質(zhì)以及軟骨下骨降解與合成偶聯(lián)正常失衡。軟骨細胞為關節(jié)軟骨中唯一的細胞類型，利用機械和化學分離方法，通過原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，可分離培養(yǎng)出純度較高的軟骨細胞［14］。軟骨細胞無特異性標志物，通過對其分泌的主要基質(zhì)成分Ⅱ型膠原免疫組化染色，結(jié)合取材部位和培養(yǎng)觀察來鑒定，Ⅱ型膠原免疫組化顯示軟骨細胞胞質(zhì)呈棕黃色，胞核不顯色［15-17］。

圖2 軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組化鑒定圖（×200）

圖3 4組軟骨細胞干預后IL-1β、IL－6表達變化圖

3.2 體外誘導軟骨細胞炎癥模型 炎癥介質(zhì)是介導骨關節(jié)炎軟骨退變的關鍵因素，在骨關節(jié)炎的病理進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。細胞因子是一組多肽類細胞調(diào)節(jié)物質(zhì)的總稱，其中IL-1β、IL-6是骨關節(jié)炎病理過程中促進關節(jié)軟骨破壞和軟骨基質(zhì)降解最主要的細胞因子。本實驗采用LPS刺激體外大鼠軟骨細胞模擬建立骨關節(jié)炎軟骨細胞的炎癥模型，在細胞水平研究骨關節(jié)炎的相關機制［18］。

3.3 電針后血清對軟骨細胞炎癥的影響 實驗結(jié)果顯示，電針后血清能夠降低LPS誘導的軟骨細胞上清液炎癥因子IL-1β、IL-6的表達，提示電針治療骨關節(jié)炎的可能分子機制是通過降低軟骨細胞中異常升高的IL-1β和IL-6水平，減少機體炎癥因子的釋放，減輕炎癥刺激，從而抑制軟骨基質(zhì)的降解，延緩軟骨的退變和骨關節(jié)炎的進一步發(fā)展。

3.4 本研究的局限性及展望 本研究的不足之處在于檢測的炎癥指標只涉及最常見的炎癥因子IL-1β和IL-6，其他相關炎癥指標如TNF-α、MMPs等也有可能發(fā)生改變，并且對軟骨細胞的形態(tài)、活性及功能產(chǎn)生影響；通過體內(nèi)實驗研究，如HE染色、免疫組化染色、電鏡觀察等，可以更為直觀地觀察電針對關節(jié)軟骨炎癥的影響；從相關信號通路及Micro-RNAs角度進一步探討電針對軟骨細胞炎癥的影響，這都將是未來的研究方向。

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