清眩降壓湯對離體大鼠胸主動脈的舒張作用及黃芩苷成分分析

林 珊 ，張 鈴 ，蔡巧燕 ，王 懷 ，陳宏偉 ，彭 軍 ，褚劍鋒

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建 福州 350122）

清眩降壓湯是治療高血壓、缺血性腦血管病、眩暈等疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有平肝潛陽、息風(fēng)、清肝熱、益肝腎等作用，對臨床上高血壓病所致的眩暈、耳鳴、失眠、頭痛等癥狀均有療效［1-3］。清眩降壓湯由天麻、鉤藤和黃芩等十多味中藥組成，主要成分為天麻素、鉤藤堿和黃芩苷等生物活性物質(zhì)。研究表明，清眩降壓湯能降低自發(fā)性高血壓大鼠的動脈血壓，同時(shí)降低NO水平，減輕高血壓的腦部損害過程；對心肌重構(gòu)、腎臟纖維化和血管重構(gòu)等靶器官的損害均有保護(hù)作用，進(jìn)一步對逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)表現(xiàn)出明顯作用［4-9］，但對清眩降壓湯治療高血壓有效成分的分析及其對主動脈血管環(huán)的作用未見報(bào)道。本文通過離體大鼠胸主動脈血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，探究清眩降壓湯對血管環(huán)的保護(hù)作用，并運(yùn)用超高液相色譜儀分析其主要成分黃芩苷，為清眩降壓湯治療高血壓的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級雄性Wistar大鼠，體

質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供（許可證號：SCXK（滬）2012-0002）。 置SPF級實(shí)驗(yàn)室中正常喂養(yǎng)，恒溫、恒濕、12 h光照／天，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清眩降壓湯生藥材購于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。黃芩苷（B20570 CAS#21967-41-9）購自上海源葉生物科技有限公司，純度經(jīng)UPLC-DAD（面積歸一法）檢測含量均大于98.0%。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 戊巴比妥鈉（上海化學(xué)試劑進(jìn)出口公司）；重酒石酸去甲腎上腺素（NE，美國Sigma公司）；乙腈、甲醇（德國MERCK公司）。K-H緩沖液（1L）由 NaCl 115.0 g，KCl 4.7 g，CaCl222.5 g，MgCl21.2 g，NaHCO325.0 g，KH2PO41.2 g 和葡萄糖10.0 g配制而成。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Angilent 1290超高液相色譜儀（德國安捷倫公司）；HV1403離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；JH-2肌張力換能器（北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所）；BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；HW-500型超級恒溫水?。ǔ啥继┟丝萍加邢薰荆?；AR2130電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；CP225D電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-300DB臺式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 取清眩降壓湯復(fù)方藥材210 g，加入10倍量水浸泡0.5 h，水煎煮 1 h，共提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至稠膏，減壓干燥10 h，粉碎，即得清眩降壓湯粉末。藥物最終配置成1 mg／mL，稀釋后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 大鼠胸主動脈環(huán)制備 取Wistar大鼠，予2%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈采血處死，迅速開胸分離胸主動脈，置于4℃含95%O2和5%CO2的預(yù)飽和K-H緩沖液中，固定血管環(huán)兩端，剔凈血管周圍的脂肪組織及結(jié)締組織，剪成長度3～4 mm的血管環(huán)。取2根不銹鋼微型三角掛鉤從血管環(huán)管腔穿過后固定，水平懸掛于20 mL浴漕內(nèi)，連接張力轉(zhuǎn)換器，使用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力。浴漕內(nèi)持續(xù)通入95%O2和5%CO2，緩慢調(diào)節(jié)血管環(huán)張力至2 g，37℃下穩(wěn)定1 h，期間每隔20 min換液一次。

2.3 對血管環(huán)的直接作用 取大鼠胸主動脈血管環(huán)，隨機(jī)分為對照組和清眩降壓湯組。清眩降壓湯組采用累積加藥法每隔 30 min加入藥物，使浴槽內(nèi)藥物的濃度遞增達(dá)到 0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL和1 mg／mL，對照組加入等量的生理鹽水。同時(shí)，記錄血管環(huán)張力值的變化情況，觀察清眩降壓湯對血管環(huán)張力的影響。

2.4 對NE預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響 取大鼠胸主動脈血管環(huán)，隨機(jī)分為對照組和清眩降壓湯組。對照組和清眩降壓湯組用1×10-6mol／L重酒石酸去甲腎上腺素（NE）預(yù)收縮血管環(huán)達(dá)穩(wěn)定后，清眩降壓湯采取累積加藥法，每隔30 min加入藥物，使浴槽內(nèi)藥物的濃度遞增達(dá)到 0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL和 1 mg／mL，對照組加入等量的生理鹽水。同時(shí)，記錄血管環(huán)張力值的變化情況，觀察清眩降壓湯對 NE（1×10-6mol／L）預(yù)收縮的胸主動脈環(huán)張力的影響。

2.5 UPLC分析清眩降壓湯的成分

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱定黃芩苷對照品適量，加入100%甲醇制備得到濃度為0.05 mg／mL的單一對照品儲備液。

2.5.2 供試品溶液的制備 稱取清眩降壓湯粉末0.2 g，置于具塞三角瓶中，并精密加入100%甲醇10.00 mL，稱重，超聲提取 20 min，放冷，再稱重，用100%甲醇補(bǔ)重后搖勻，取其上清液，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 Acclaim UPLC RSLC 120 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B）梯度洗脫，進(jìn)樣量 2 μL，流速 0.400 mL／min，柱溫 30℃，檢測波長 280 nm。

2.5.4 成分分析 取黃芩苷對照品溶液，以吸收峰的峰面積對含量作線性回歸。取清眩降壓湯樣品，分別按“2.5.2項(xiàng)”下制備供試品溶液，按“2.5.3項(xiàng)”下色譜條件，進(jìn)樣量2 μL，并記錄其色譜峰的峰面積積分值，通過線性回歸方程計(jì)算清眩降壓湯中黃芩苷的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 清眩降壓湯對胸主動脈血管環(huán)收縮的影響清眩降壓湯對血管環(huán)的張力并無明顯改變，與對照組比較無顯著差異，結(jié)果表明，清眩降壓湯對胸主動脈血管環(huán)的靜息張力不具影響，結(jié)果見圖1。

3.2 清眩降壓湯對NE預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響加入 NE（1×10-6mol／L）預(yù)收縮血管環(huán)后，累計(jì)加入清眩降壓湯可引起血管環(huán)濃度依賴性舒張。清眩降壓湯對NE引起的血管收縮具有一定的舒張作用，與對照組比較，具有顯著性差異（P＜0.05），且濃度越高，舒張作用越明顯，存在量效關(guān)系。在NE體系下，清眩降壓湯對血管的最大舒張力達(dá)（88.35±2.21）%，結(jié)果見圖 2。

圖1 清眩降壓湯對靜息狀態(tài)下血管環(huán)張力的影響（n＝6）

圖2 清眩降壓湯對NE預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響（n＝6）

3.3 清眩降壓湯成分分析及黃芩苷含量測定 黃芩苷的峰面積積分值與進(jìn)樣量之間關(guān)系的回歸方程為 Y＝11736X＋33.196（R2＝0.999），說明黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在0.01～0.1 mg／mL之間能呈良好的線性關(guān)系。如圖3所示，A、B分別為黃芩苷及清眩降壓湯的UPLC色譜圖。結(jié)果顯示，清眩降壓湯與黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品均在同一時(shí)間出峰，表明清眩降壓湯中含有黃芩苷。且與其他色譜峰比較，黃芩苷的相對峰面積最高，是清眩降壓湯中最主要化學(xué)成分。經(jīng)黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算，清眩降壓湯中黃芩苷的含量為0.83 mg／g。結(jié)果見圖3和表1。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品及清眩降壓湯的UPLC色譜圖

表1 清眩降壓湯的黃芩苷含量測定

4 討論

高血壓在我國患病率高，已經(jīng)成為我國數(shù)量大的重大慢性疾病之一［10-12］。研究數(shù)據(jù)表明，血壓的增高，會導(dǎo)致主動脈僵硬度和體質(zhì)量指數(shù)的增加，而主動脈的張力、膨脹性、僵硬度指數(shù)的增加又可作為預(yù)測收縮壓、舒張壓和脈壓增高的指標(biāo)，因此主動脈僵硬度增加是預(yù)示血壓增高的重要決定因素［13］。長期的壓力負(fù)荷過大可引起血管壁張力持續(xù)增高，一方面引起主動脈發(fā)生外向肥厚性重構(gòu)；另一方面可導(dǎo)致各種細(xì)胞因子變化，從而引起血管舒張功能異常。大動脈是血液流通的主要管道，其管壁肥厚會導(dǎo)致血管的擴(kuò)張性下降、僵硬度增加，最終影響血管的正常功能［14］。因此，舒張血管、改善高血壓進(jìn)程中大動脈的損傷程度及修復(fù)血管情況是評價(jià)抗高血壓藥物的主要療效指標(biāo)之一［15－16］。

清眩降壓湯是陳可冀院士60余年臨床工作中治療高血壓的驗(yàn)方，臨床研究中表明治療高血壓療效確切，前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)清眩降壓湯能顯著抑制自發(fā)性高血壓大鼠血壓升高和保護(hù)靶器官［5-8］。黃芩是傳統(tǒng)中醫(yī)用藥，對溫?zé)岵?、高血壓等病具有治療效果，黃芩主要含黃芩苷等黃酮類化合物。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)工作中，我們在實(shí)驗(yàn)摸索中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可作為清眩降壓湯中的指標(biāo)成分，其響應(yīng)值最大，成分分析時(shí)色譜峰非常明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。清眩降壓湯的成分分析中，結(jié)果表明黃芩苷為最主要成分之一。有研究報(bào)道，黃芩苷對NE和KCl引起的去內(nèi)皮和內(nèi)皮完整大鼠胸主動脈環(huán)的收縮均有舒張作用［17－18］。 本研究結(jié)果顯示，清眩降壓湯能顯著舒張NE誘導(dǎo)內(nèi)皮完整大鼠胸主動脈血管環(huán)的收縮，黃芩苷為清眩降壓湯治療高血壓的主要有效成分之一。

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