八寶丹抑制胃癌細胞增殖與誘導細胞凋亡的實驗研究

尚海霞 ，楊 弘 ，靳祎祎 ，彭 軍 ，2，褚劍鋒 ，2，莊群川 ，2，林久茂 ，2

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

胃癌是起源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，是世界上常見的惡性消化道腫瘤之一，嚴重威脅人類健康［1］。近年來其發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢［2］。目前胃癌的主要治療方法有手術(shù)、化療、放療等，化療易對藥物產(chǎn)生耐藥性而使患者復發(fā)轉(zhuǎn)移，臨床療效不佳，成為腫瘤治療的疑難點。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤療效顯著，毒副作用小，具有整體調(diào)節(jié)的特點，成為腫瘤治療的重要手段，備受關(guān)注。八寶丹（BBD）在臨床上治療胃癌等惡性腫瘤，可提高癌癥患者的化療耐受、減輕化療藥物的毒副反應(yīng)、提高生活質(zhì)量、延長生存期等［3］。但八寶丹對胃癌細胞的抑制作用及其分子機制尚不明確。本實驗通過體外細胞培養(yǎng)，探討八寶丹對胃癌細胞AGS和MGC-803增殖的抑制作用及其誘導細胞凋亡的作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞株 人胃癌細胞株AGS和MGC-803購自中科院上海細胞生物研究所，保存于福建中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗中心。

1.2 實驗藥物 八寶丹（麝香、羚羊角、牛黃、蛇膽、三七、珍珠）購自廈門中藥廠股份有限公司。

1.3 實驗試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶、二甲亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司；Hoechst 33258染色試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、－80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；形態(tài)學顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1、Countes?全自動細胞計數(shù)儀（美國 Life公司）。

2 實驗方法

2.1 BBD溶液的制備 將八寶丹粉末用PBS配制成 25 mg／mL的藥液，超聲溶解、高壓滅菌后于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng) 將胃癌細胞株AGS、MGC-803置于含 10%滅活 FBS、100 U／mL 青霉素和 100 μg／mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2和飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞單層貼壁生長，當匯合度至80%～90%時，加入1 mL胰蛋白酶（含0.25%EDTA）消化后，加入2 mL完全培養(yǎng)基中和以終止消化，1000 r／min離心3 min，棄上清液，收集沉淀細胞，用完全培養(yǎng)基重懸制成新細胞懸液后傳代。

2.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的AGS和MGC-803胃癌細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞密度為 1×105個／mL，每孔 100 μL，置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞匯合度達到50%～60%時，棄掉原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度BBD（終濃度分別為 0、0.25、0.5、0.75、1 mg／mL）的培養(yǎng)基，每孔 100 μL，分別干預 24 h和 48 h后吸棄各孔溶液，每孔加入 0.5 mg／mL的MTT溶液100 μL，37℃孵育4 h后吸棄各孔中的液體，加入DMSO 100 μL／孔，室溫靜置 10 min，充分振蕩混勻，使結(jié)晶充分溶解并混勻，采用全自動酶標儀于570 nm波長處測定各組吸光度值（A值），并計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率（%）＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。

2.4 細胞形態(tài)觀察與計數(shù) 取對數(shù)生長期的AGS和MGC-803細胞接種于6孔板，調(diào)整細胞密度為2.5×105個／孔，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細胞匯合度達到50%～60%時，用不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75、1 mg／mL）干預 24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照記錄。拍照后細胞予消化、中和、離心、重懸處理，臺盼藍染色，于Countes?全自動細胞計數(shù)儀對AGS和MGC-803細胞進行計數(shù)分析。

2.5 集落形成實驗 AGS和MGC-803細胞以2.5×105個／孔接種于6孔板，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞匯合度達到50%～60%時，加入不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75、1 mg／mL）干預 24 h。吸棄培養(yǎng)液，用PBS清洗，經(jīng)過消化、中和、離心、重懸操作，將細胞按500個／孔接種于12孔板中，2～3 d換液，且換液前于倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，連續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，當培養(yǎng)板孔中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，停止培養(yǎng)。吸棄上清，用PBS清洗2～3次。加入4%多聚甲醛固定10 min，吸棄4%多聚甲醛后用PBS清洗2～3遍，最后每孔用結(jié)晶紫染色液染色20 min，吸棄染色液，用高壓過的純水清洗3遍，相機拍照觀察集落形成情況。

2.6 Hoechst染色檢測細胞凋亡 AGS和MGC-803細胞以1.5×105個／孔接種于12孔板，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞匯合度達到50%～60%時，加入不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、1 mg／mL）干預24 h。用4%多聚甲醛室溫固定10 min，然后吸棄，每孔加入200 μL分裝好的hoechst 33258工作液染色，4℃避光反應(yīng)15 min，用PBS沖洗細胞3次，最后一次留在孔中。熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況并拍照（×200）。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度BBD干預后AGS、MGC-803抑制情況比較 MTT檢測結(jié)果顯示不同濃度的BBD可顯著抑制胃癌細胞AGS和MGC-803的增殖，具有明顯的劑量依賴和時間依賴作用。見表1、表2。

表1 不同濃度BBD干預后AGS、MGC-803抑制率比較（n＝8，）

表1 不同濃度BBD干預后AGS、MGC-803抑制率比較（n＝8，）

注：與對照組比較，1） P＜0.01。

組別對照組實驗組BBD 濃度（mg／mL）0 0.25 0.50 0.75 1 AGS抑制率／% MGC-803抑制率／%24 h 0±2.82 7.83±2.331）18.46±5.411）38.95±3.731）68.70±3.531）48 h 0±1.74 27.49±5.701）33.61±6.631）63.16±4.461）88.99±1.671）24 h 0±2.19 6.41±4.261）7.16±4.051）13.43±3.281）41.49±3.421）48 h 0±3.34 22.59±4.321）30.82±3.301）41.56±4.481）53.82±4.851）

表2 不同濃度BBD干預后AGS、MGC-803細胞數(shù)比較（n＝8，）

表2 不同濃度BBD干預后AGS、MGC-803細胞數(shù)比較（n＝8，）

注：與對照組比較，1） P＜0.01。

組別對照組實驗組BBD濃度（mg／mL）0 0.25 0.50 0.75 1 AGS／×105個9.59±0.47 8.75±0.381）6.76±0.351）6.35±0.521）0.51±0.041）MGC-803／×105個18.60±0.66 9.24±0.621）8.24±0.581）7.29±0.611）6.19±0.291）

3.2 BBD對細胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示胃癌細胞AGS和MGC-803經(jīng)不同濃度的BBD干預24 h后，隨著藥物濃度的增加，AGS和MGC-803細胞密度逐漸減少，懸浮細胞增多，部分細胞皺縮變圓。見圖1。

3.3 BBD對細胞集落形成能力的影響 集落形成實驗結(jié)果顯示BBD對胃癌細胞AGS、MGC-803的集落形成能力有明顯的抑制作用，具有一定的劑量依賴性。見圖2。

3.4 BBD對細胞凋亡的影響 Hoechst 33258染色結(jié)果顯示BBD具有誘導胃癌細胞AGS、MGC-803凋亡的作用，凋亡細胞數(shù)隨著BBD濃度增加而逐漸增多，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用。見圖3。

4 討 論

中醫(yī)理論認為腫瘤形成多由于氣滯血瘀，或熱毒內(nèi)蘊，或痰凝濕聚，或正氣虧虛、久之瘀積邪毒而致。腫瘤的化療藥物多為細胞毒性藥物，大多具有嚴重不良反應(yīng)，直接影響腫瘤的療效，因此從天然藥物中尋找具有抗腫瘤活性且不良反應(yīng)較小的成分是腫瘤治療的研究方向之一。研究證實中醫(yī)藥具有抑制胃癌細胞增殖、誘導凋亡、調(diào)節(jié)免疫、抑制血管新生、抑制端粒酶的表達、抗侵襲轉(zhuǎn)移及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面的作用［4］。BBD以天然牛黃、珍珠、蛇膽、三七、麝香、羚羊角等八味名貴中藥精制而成，諸藥合用共奏清熱解毒、活血化瘀之效，符合中醫(yī)辨證抗腫瘤的機理，現(xiàn)代藥理學研究證明麝香、牛黃、三七等均有明顯抗腫瘤療效［5-7］。在本研究中，MTT結(jié)果顯示，BBD對胃癌細胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈一定的時間和濃度依賴性。

近年來，隨著人們對腫瘤研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與腫瘤細胞增殖過度和分化異常有關(guān)，而且與細胞凋亡受阻密切相關(guān)［8］。細胞集落形成實驗是研究腫瘤細胞存活和細胞增殖能力最常用的方法之一，且結(jié)果呈現(xiàn)直觀。集落實驗結(jié)果提示BBD對胃癌細胞AGS和MGC-803的集落形成能力具有明顯的抑制作用，進一步證實BBD具有抑制胃癌細胞增殖的作用。

圖1 不同濃度BBD干預24 h AGS、MGC-803細胞形態(tài)圖（×200）

圖2 不同濃度BBD干預AGS、MGC-803細胞集落形成染色圖

圖3 不同濃度BBD干預AGS、MGC-803細胞Hoechst染色圖（×200）

細胞凋亡是一種程序化的細胞死亡過程，典型的細胞凋亡形態(tài)學改變包括細胞膜出泡、細胞皺縮、核染色質(zhì)固縮和凋亡小體形成［9］。Hoechst染色是一種經(jīng)典而又快速的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法［10］。當細胞發(fā)生凋亡時，與鄰周細胞脫離，胞漿聚縮，核染色體密度增高呈半月形，且在核膜周邊凝集，核仁發(fā)生裂解，細胞內(nèi)陷，進而形成凋亡小體。本實驗中，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，BBD能夠誘導胃癌細胞AGS和MGC-803的凋亡，且呈劑量依賴性。

綜上所述，本研究結(jié)果提示BBD抑制胃癌細胞增殖和誘導細胞凋亡是其治療胃癌的重要作用機制。但BBD治療胃癌等惡性腫瘤的作用機制研究尚不深入及不系統(tǒng)，亟待進一步的研究探索。

［1］ VAN CUTSEM E，SAGAERT X，TOPAL B，et al.Gastric cancer ［J］.Lancet，2016，388（10060）：2654-2664.

［2］ MCLEAN M H，EL-OMAR E M.Genetics of gastric cancer ［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2014，11（11）：664-674.

［3］ 耿冬梅，張良明，隋銘驊.八寶丹膠囊輔助晚期腫瘤化療的研究［J］.山西醫(yī)藥雜志，2010，39（6）：562-564.

［4］ 王亞坤，謝長生，樓金杰，等.中醫(yī)藥治療胃癌的實驗研究進展［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2015，33（11）：2743-2745.

［5］ 孟照華，單禮成，曾家修，等.皮下埋藏麝香對BALB／c純系小鼠惡性腫瘤生長影響的實驗研究［J］.中國腫瘤臨床，1998，25（11）：834-836.

［6］ 武凡，張樹三，康格非.三七皂甙對肝纖維化大鼠分泌型磷脂A2和腫瘤壞死因子表達的影響［J］.中華肝臟病雜志，2003，11（1）：51-52.

［7］ 李蒙，于建勛.單味中藥誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究現(xiàn)狀及展望［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21（1）：74-76.

［8］ WUCHTER C，KARAWAJEW L，RUPPERT V，et al.Constitutive expression levels of CD95 and Bcl-2 as well as CD95 function and spontaneous apoptosis in vitro do not predict the response to induction chemotherapy and relapse rate in childhood acute lymphoblastic leukaemia ［J］.Br J Haematol，2000，100（1）：154-160.

［9］ 孫沛林，金京春，王瑩，等.黃芩素誘導胃癌MGC-803細胞凋亡［J］.腫瘤，2017，37（10）：1041-1046.

［10］朱彩平，張聲華，肖軍霞.枸杞多糖誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的形態(tài)學研究［J］.食品科學，2010，31（19）：329-334.