縮泉固尿方對(duì)壓力性尿失禁模型大鼠TGFβ-3表達(dá)的干預(yù)研究

苑述剛，聶露霞，馬少丹，廖水亨，南麗紅，阮時(shí)寶

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是尿失禁最常見的類型，臨床多以咳嗽、噴嚏、大笑、鍛煉等腹壓突然增加時(shí)出現(xiàn)尿液自尿道口流出為表現(xiàn)，其過程不伴逼尿肌收縮。嚴(yán)重者在日?；顒?dòng)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康［1］。據(jù)報(bào)道，我國成年女性SUI的發(fā)病率約在10%～40%，絕經(jīng)后女性為本病的高發(fā)人群，可達(dá)30%左右［2］。隨著人口老齡化的進(jìn)程加快，SUI的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于中、重度SUI患者多采用手術(shù)療法，輕、中度多用藥物、盆底肌肉鍛煉等，然較多的不良反應(yīng)及后遺癥限制了其應(yīng)用［3-4］。中醫(yī)對(duì)尿失禁的治療手段也很多，已見報(bào)道的治療方法主要有復(fù)方加減、針灸、針?biāo)幗Y(jié)合以及推拿按摩等，療效顯著，副作用少，且遠(yuǎn)期療效較穩(wěn)定，已展示了良好的前景。本研究通過觀察縮泉固尿方對(duì)SUI模型大鼠陰道前壁和肛提肌中轉(zhuǎn)化生長因子β-3（transforming growth factor β-3，TGFβ-3）mRNA表達(dá)的影響，探索其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 凝膠成像儀、水平電泳儀、基因擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司）；5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物 Trizol（RNA提取試劑盒）、cDNA一鏈合成試劑盒（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）、PCR Mix（PCR聚合酶）、DNA maker、核酸染液均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TAE（50×）緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

縮泉固尿方由熟地、西洋參、黃芪、桑螵蛸、補(bǔ)骨脂等中藥組成，購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，經(jīng)鑒定均符合2015版《中華人民共和國藥典》［5］相關(guān)規(guī)定。依據(jù)縮泉固尿方臨床常用藥物比例，水煎2次，過濾濃縮，4℃冰箱保存，備用。鹽酸米多君（國藥集團(tuán)川藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：160301）

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（使用合格證：SYXK（閩）2014-005）提供的清潔級(jí)SD大鼠雌性74只，雄性16只，鼠齡約6周，體重約240～300 g。隨機(jī)數(shù)字表法選取雌鼠64只以4∶1比例與雄鼠合籠，常規(guī)飼養(yǎng)至30 d左右分娩。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥 將分娩后SD大鼠行陰道擴(kuò)張（2次）＋卵巢切除法復(fù)制SUI模型，建模1個(gè)月后以尿流動(dòng)力學(xué)驗(yàn)證模型成功與否，經(jīng)檢驗(yàn)64只大鼠建模成功54只。將模型成功大鼠隨機(jī)分為5組，陽性對(duì)照組10只，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組每組各11只，將未分娩的10只雌鼠設(shè)為正常對(duì)照組，共6組。分組后進(jìn)行藥物干預(yù)，低、中、高劑量組每日按 5.7、11.4、22.8 g（kg·d）予縮泉固尿方藥液灌胃，陽性對(duì)照組予相應(yīng)劑量鹽酸米多君灌胃，正常對(duì)照組、模型組均予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥1個(gè)月。

2.2 尿動(dòng)力學(xué)檢測 造模結(jié)束1個(gè)月后，禁食12 h，常規(guī)麻醉后仰臥位固定SD大鼠。尿道口消毒液消毒，將硬膜外導(dǎo)管涂上潤滑劑經(jīng)尿道置入膀胱約3.5 cm，并將三通管一端與尿動(dòng)力學(xué)檢測儀相連，再將微量輸液泵也連于三通管。管道內(nèi)充滿無菌生理鹽水排出空氣。

2.2.1 最大膀胱容量檢測 大鼠排空膀胱后，將無菌生理鹽水通過微量輸液泵以0.3 mL／min的速度注入膀胱，注入的同時(shí)校零尿動(dòng)力學(xué)檢測儀并檢測。以尿道口剛開始出現(xiàn)液體的用時(shí)時(shí)間乘以速度算出最大膀胱容量，每只大鼠檢測3次，取其平均值。

2.2.2 腹漏尿點(diǎn)壓 大鼠排空膀胱后，向膀胱內(nèi)注入1／2最大膀胱容量的無菌生理鹽水。用手指由輕到重按壓大鼠上腹部，使腹壓逐漸上升以模擬 Valsalva動(dòng)作，按壓的同時(shí)校零尿動(dòng)力學(xué)檢測儀并檢測，見液體自尿道口流出后停止按壓，此時(shí)儀器顯示膀胱內(nèi)壓即為腹漏尿點(diǎn)壓（abdominal leak point pressures,ALPP），每只大鼠檢測3次，取其平均值。

2.3 RT-PCR檢測大鼠陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA 的表達(dá)

2.3.1 標(biāo)本的取材 大鼠于末次給藥后，禁食不禁水12 h，常規(guī)麻醉后迅速取出陰道前壁和肛提肌。用預(yù)冷的生理鹽水洗去血漬，濾紙吸干水分后放入凍存管于液氮中速凍，-80℃冰箱保存，待提RNA。

2.3.2 總RNA抽提 取出凍存組織置于1.5 mL EP管內(nèi)，加入200 μL的Trizol，并用手術(shù)剪將組織剪碎后用組織破碎儀進(jìn)行破碎，再往管內(nèi)加入800 μL的Trizol溶液，混勻后室溫靜置20 min。每1 mL Trizol中加200 μL的氯仿，用力搖晃混勻后室溫靜置10 min。再4℃高速離心機(jī)12 000 r／m離心15 min讓其分層，RNA位于上層水相中，小心移出上層水相0.4 mL左右至另一無RNA酶的1.5 mL EP管中，按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。

2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng) 按下列組分配制DNA去除反應(yīng)液：4×gDNA wiper Mix：4 μL，Total RNA：1 μg （根據(jù)各個(gè)樣濃度加樣），RNase Free dH2O：up to 16 μL，以上反應(yīng)液振蕩混勻，短暫離心，42℃2 min。按下列組分配制RT反應(yīng)液：5×qRT SuperMix Ⅱ：4 μL，第一步反應(yīng)液：16 μL，以上混合液振蕩混勻，短暫離心，50℃孵育30 min，85℃孵育5 min，得到的cDNA溶液用于PCR反應(yīng)。

2.3.4 PCR反應(yīng) ① 引物設(shè)計(jì)與合成：參照NCBI目的基因，設(shè)計(jì)TGFβ-3上下游引物，內(nèi)參照基因?yàn)镚APDH。TGFβ-3上游引物為5'-TCCGTTTCAA TGTGTCCTCAG-3'，下游引物為 5'－GCTGCTTGGCTATGTGTTCA-3'，擴(kuò)增片段為160 bp。GAPDH上游引物為 5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游引物為5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'，擴(kuò)增片段為107bp。② RT-PCR反應(yīng)體系：2×rTaq PCR Mix10 μL，上游引物（10 μM） 0.8 μL，下游引物（10 μM）0.8 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 加至20 μL。③PCR反應(yīng)體系按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性：94 ℃（5 min）；變性：94 ℃（30 s）；退火：58 ℃（30 s）；延伸：72 ℃（20 s），30 個(gè)循環(huán)；延伸：72 ℃（7 min）。反應(yīng)完成后將擴(kuò)增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍攝電泳圖像，分析各電泳條帶之IOD值，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析，比值表示其相對(duì)含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

表1 6組大鼠給藥前后ALPP值比較（）cmH2O

表1 6組大鼠給藥前后ALPP值比較（）cmH2O

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組給藥前70.23±1.82 43.42±2.101）43.69±1.911）44.53±1.691）43.98±1.411）44.14±1.361）給藥后69.79±2.80 44.27±1.261）55.13±1.382）48.40±2.012）54.77±1.952）62.75±1.462）

圖1 縮泉固尿方對(duì)SUI模型大鼠陰道前壁中TGFβ-3 mRNA表達(dá)的影響

圖2 縮泉固尿方對(duì)SUI模型大鼠肛提肌中TGFβ-3 mRNA表達(dá)的影響

4 討 論

SUI的發(fā)病機(jī)制一直未有定論，最早提出的是尿道支持解剖學(xué)障礙，并認(rèn)為“壓力傳導(dǎo)理論”是其發(fā)生過程；后有研究發(fā)現(xiàn)年齡增大和盆底手術(shù)造成尿道括約肌功能不良也可引發(fā)SUI。隨著研究不斷深入，單一的解剖學(xué)和功能學(xué)機(jī)制解釋已無法被認(rèn)同，所以分子生物學(xué)的深入研究成為新方向。TGFβ-3被認(rèn)為是機(jī)體創(chuàng)傷后參與修復(fù)過程最重要的生長因子之一，是 TGFβ家族亞型之一［6］。研究表明TGFβ-3能促進(jìn)膠原等間質(zhì)蛋白質(zhì)的合成，又可通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶及刺激其抑制劑的合成而使膠原的降解減慢，通過對(duì)膠原蛋白的促進(jìn)合成和抑制降解雙向調(diào)節(jié)作用來增加肌肉組織彈性［7］。目前普遍認(rèn)為尿道支撐結(jié)構(gòu)的功能異常是SUI的主要發(fā)生原因，所以設(shè)想分娩損傷或衰老后盆底組織中的TGFβ-3有所下降，使組織的膠原蛋白合成減弱或消失，肌肉彈性降低，肌力支撐不夠而發(fā)生SUI。張瑩安等［8］研究發(fā)現(xiàn)SUI模型大鼠陰道前壁及肛提肌中TGFβ-3 mRNA含量較正常組明顯降低。

表2 6組大鼠陰道前壁、肛提肌中TGF-β3 mRNA的表達(dá)（）

表2 6組大鼠陰道前壁、肛提肌中TGF-β3 mRNA的表達(dá)（）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

動(dòng)物數(shù)／n 10 11 10 11 11 11組別正常對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組給藥劑量 ／（g／kg）——0.0015 5.7 11.4 22.8陰道前壁1.539±0.179 0.824±0.1711）1.096±0.1153）0.884±0.133 0.942±0.1252）1.199±0.1163）肛提肌1.561±0.085 0.745±0.1021）0.879±0.1582）0.805±0.121 0.863±0.1032）0.914±0.1393）

傳統(tǒng)中醫(yī)多將SUI歸屬中醫(yī)“小便不禁”“膀胱咳”“遺尿”等范疇，臨床主要表現(xiàn)為小便排出異常，并認(rèn)為其病因病機(jī)與“氣”密切相關(guān)，而氣的生理功能主要依賴于脾腎二臟［9］?？s泉固尿方系我國現(xiàn)代著名中醫(yī)藥學(xué)家俞長榮教授治療尿失禁五十多年的經(jīng)驗(yàn)效方。俞老認(rèn)為，本病主要病因病機(jī)的形成與肺脾腎不足，氣攝無權(quán)，膀胱失約，開闔失常有關(guān)。氣有固攝之功，對(duì)人體津液有固護(hù)統(tǒng)攝和控制功能，若氣虛不攝津，則致小便失禁。另外，腎與膀胱相表里，腎的封藏、固攝、溫煦、氣化作用直接影響膀胱對(duì)人體尿液的貯藏與排泄功能。本病以肺脾腎虧虛、氣失固攝為本，膀胱失約為標(biāo)，法當(dāng)標(biāo)本同治。宗法隨證立、方從法出之則，縮泉固尿方由黃芪、補(bǔ)骨脂、西洋參、桑螵蛸、益智仁、熟地、甘草等中藥組成，具有補(bǔ)脾益腎，固孚縮尿之功。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA表達(dá)的分析，結(jié)果表明SUI模型鼠中陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA的表達(dá)均低于正常對(duì)照組，縮泉固尿方中、高劑量組較模型組 TGFβ-3 mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。證實(shí)TGFβ-3與SUI的發(fā)生具有相關(guān)性，而縮泉固尿方可能通過提高SUI模型鼠中陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA的表達(dá)對(duì)SUI產(chǎn)生治療作用，是其可能的作用機(jī)制之一。

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