縮泉固尿方對壓力性尿失禁模型大鼠TGFβ-3表達(dá)的干預(yù)研究

苑述剛，聶露霞，馬少丹，廖水亨，南麗紅，阮時寶

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是尿失禁最常見的類型，臨床多以咳嗽、噴嚏、大笑、鍛煉等腹壓突然增加時出現(xiàn)尿液自尿道口流出為表現(xiàn)，其過程不伴逼尿肌收縮。嚴(yán)重者在日?；顒訒r也會出現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康［1］。據(jù)報道，我國成年女性SUI的發(fā)病率約在10%～40%，絕經(jīng)后女性為本病的高發(fā)人群，可達(dá)30%左右［2］。隨著人口老齡化的進(jìn)程加快，SUI的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐步上升趨勢?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于中、重度SUI患者多采用手術(shù)療法，輕、中度多用藥物、盆底肌肉鍛煉等，然較多的不良反應(yīng)及后遺癥限制了其應(yīng)用［3-4］。中醫(yī)對尿失禁的治療手段也很多，已見報道的治療方法主要有復(fù)方加減、針灸、針?biāo)幗Y(jié)合以及推拿按摩等，療效顯著，副作用少，且遠(yuǎn)期療效較穩(wěn)定，已展示了良好的前景。本研究通過觀察縮泉固尿方對SUI模型大鼠陰道前壁和肛提肌中轉(zhuǎn)化生長因子β-3（transforming growth factor β-3，TGFβ-3）mRNA表達(dá)的影響，探索其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 凝膠成像儀、水平電泳儀、基因擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司）；5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物 Trizol（RNA提取試劑盒）、cDNA一鏈合成試劑盒（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）、PCR Mix（PCR聚合酶）、DNA maker、核酸染液均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TAE（50×）緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

縮泉固尿方由熟地、西洋參、黃芪、桑螵蛸、補(bǔ)骨脂等中藥組成，購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，經(jīng)鑒定均符合2015版《中華人民共和國藥典》［5］相關(guān)規(guī)定。依據(jù)縮泉固尿方臨床常用藥物比例，水煎2次，過濾濃縮，4℃冰箱保存，備用。鹽酸米多君（國藥集團(tuán)川藥有限公司，生產(chǎn)批號：160301）

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（使用合格證：SYXK（閩）2014-005）提供的清潔級SD大鼠雌性74只，雄性16只，鼠齡約6周，體重約240～300 g。隨機(jī)數(shù)字表法選取雌鼠64只以4∶1比例與雄鼠合籠，常規(guī)飼養(yǎng)至30 d左右分娩。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥 將分娩后SD大鼠行陰道擴(kuò)張（2次）＋卵巢切除法復(fù)制SUI模型，建模1個月后以尿流動力學(xué)驗(yàn)證模型成功與否，經(jīng)檢驗(yàn)64只大鼠建模成功54只。將模型成功大鼠隨機(jī)分為5組，陽性對照組10只，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組每組各11只，將未分娩的10只雌鼠設(shè)為正常對照組，共6組。分組后進(jìn)行藥物干預(yù)，低、中、高劑量組每日按 5.7、11.4、22.8 g（kg·d）予縮泉固尿方藥液灌胃，陽性對照組予相應(yīng)劑量鹽酸米多君灌胃，正常對照組、模型組均予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥1個月。

2.2 尿動力學(xué)檢測 造模結(jié)束1個月后，禁食12 h，常規(guī)麻醉后仰臥位固定SD大鼠。尿道口消毒液消毒，將硬膜外導(dǎo)管涂上潤滑劑經(jīng)尿道置入膀胱約3.5 cm，并將三通管一端與尿動力學(xué)檢測儀相連，再將微量輸液泵也連于三通管。管道內(nèi)充滿無菌生理鹽水排出空氣。

2.2.1 最大膀胱容量檢測 大鼠排空膀胱后，將無菌生理鹽水通過微量輸液泵以0.3 mL／min的速度注入膀胱，注入的同時校零尿動力學(xué)檢測儀并檢測。以尿道口剛開始出現(xiàn)液體的用時時間乘以速度算出最大膀胱容量，每只大鼠檢測3次，取其平均值。

2.2.2 腹漏尿點(diǎn)壓 大鼠排空膀胱后，向膀胱內(nèi)注入1／2最大膀胱容量的無菌生理鹽水。用手指由輕到重按壓大鼠上腹部，使腹壓逐漸上升以模擬 Valsalva動作，按壓的同時校零尿動力學(xué)檢測儀并檢測，見液體自尿道口流出后停止按壓，此時儀器顯示膀胱內(nèi)壓即為腹漏尿點(diǎn)壓（abdominal leak point pressures,ALPP），每只大鼠檢測3次，取其平均值。

2.3 RT-PCR檢測大鼠陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA 的表達(dá)

2.3.1 標(biāo)本的取材 大鼠于末次給藥后，禁食不禁水12 h，常規(guī)麻醉后迅速取出陰道前壁和肛提肌。用預(yù)冷的生理鹽水洗去血漬，濾紙吸干水分后放入凍存管于液氮中速凍，-80℃冰箱保存，待提RNA。

2.3.2 總RNA抽提 取出凍存組織置于1.5 mL EP管內(nèi)，加入200 μL的Trizol，并用手術(shù)剪將組織剪碎后用組織破碎儀進(jìn)行破碎，再往管內(nèi)加入800 μL的Trizol溶液，混勻后室溫靜置20 min。每1 mL Trizol中加200 μL的氯仿，用力搖晃混勻后室溫靜置10 min。再4℃高速離心機(jī)12 000 r／m離心15 min讓其分層，RNA位于上層水相中，小心移出上層水相0.4 mL左右至另一無RNA酶的1.5 mL EP管中，按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。

2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng) 按下列組分配制DNA去除反應(yīng)液：4×gDNA wiper Mix：4 μL，Total RNA：1 μg （根據(jù)各個樣濃度加樣），RNase Free dH2O：up to 16 μL，以上反應(yīng)液振蕩混勻，短暫離心，42℃2 min。按下列組分配制RT反應(yīng)液：5×qRT SuperMix Ⅱ：4 μL，第一步反應(yīng)液：16 μL，以上混合液振蕩混勻，短暫離心，50℃孵育30 min，85℃孵育5 min，得到的cDNA溶液用于PCR反應(yīng)。

2.3.4 PCR反應(yīng) ① 引物設(shè)計(jì)與合成：參照NCBI目的基因，設(shè)計(jì)TGFβ-3上下游引物，內(nèi)參照基因?yàn)镚APDH。TGFβ-3上游引物為5'-TCCGTTTCAA TGTGTCCTCAG-3'，下游引物為 5'－GCTGCTTGGCTATGTGTTCA-3'，擴(kuò)增片段為160 bp。GAPDH上游引物為 5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游引物為5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'，擴(kuò)增片段為107bp。② RT-PCR反應(yīng)體系：2×rTaq PCR Mix10 μL，上游引物（10 μM） 0.8 μL，下游引物（10 μM）0.8 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 加至20 μL。③PCR反應(yīng)體系按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性：94 ℃（5 min）；變性：94 ℃（30 s）；退火：58 ℃（30 s）；延伸：72 ℃（20 s），30 個循環(huán)；延伸：72 ℃（7 min）。反應(yīng)完成后將擴(kuò)增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍攝電泳圖像，分析各電泳條帶之IOD值，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析，比值表示其相對含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

表1 6組大鼠給藥前后ALPP值比較（）cmH2O

表1 6組大鼠給藥前后ALPP值比較（）cmH2O

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組給藥前70.23±1.82 43.42±2.101）43.69±1.911）44.53±1.691）43.98±1.411）44.14±1.361）給藥后69.79±2.80 44.27±1.261）55.13±1.382）48.40±2.012）54.77±1.952）62.75±1.462）

圖1 縮泉固尿方對SUI模型大鼠陰道前壁中TGFβ-3 mRNA表達(dá)的影響

圖2 縮泉固尿方對SUI模型大鼠肛提肌中TGFβ-3 mRNA表達(dá)的影響

4 討 論

SUI的發(fā)病機(jī)制一直未有定論，最早提出的是尿道支持解剖學(xué)障礙，并認(rèn)為“壓力傳導(dǎo)理論”是其發(fā)生過程；后有研究發(fā)現(xiàn)年齡增大和盆底手術(shù)造成尿道括約肌功能不良也可引發(fā)SUI。隨著研究不斷深入，單一的解剖學(xué)和功能學(xué)機(jī)制解釋已無法被認(rèn)同，所以分子生物學(xué)的深入研究成為新方向。TGFβ-3被認(rèn)為是機(jī)體創(chuàng)傷后參與修復(fù)過程最重要的生長因子之一，是 TGFβ家族亞型之一［6］。研究表明TGFβ-3能促進(jìn)膠原等間質(zhì)蛋白質(zhì)的合成，又可通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶及刺激其抑制劑的合成而使膠原的降解減慢，通過對膠原蛋白的促進(jìn)合成和抑制降解雙向調(diào)節(jié)作用來增加肌肉組織彈性［7］。目前普遍認(rèn)為尿道支撐結(jié)構(gòu)的功能異常是SUI的主要發(fā)生原因，所以設(shè)想分娩損傷或衰老后盆底組織中的TGFβ-3有所下降，使組織的膠原蛋白合成減弱或消失，肌肉彈性降低，肌力支撐不夠而發(fā)生SUI。張瑩安等［8］研究發(fā)現(xiàn)SUI模型大鼠陰道前壁及肛提肌中TGFβ-3 mRNA含量較正常組明顯降低。

表2 6組大鼠陰道前壁、肛提肌中TGF-β3 mRNA的表達(dá)（）

表2 6組大鼠陰道前壁、肛提肌中TGF-β3 mRNA的表達(dá)（）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

動物數(shù)／n 10 11 10 11 11 11組別正常對照組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組給藥劑量 ／（g／kg）——0.0015 5.7 11.4 22.8陰道前壁1.539±0.179 0.824±0.1711）1.096±0.1153）0.884±0.133 0.942±0.1252）1.199±0.1163）肛提肌1.561±0.085 0.745±0.1021）0.879±0.1582）0.805±0.121 0.863±0.1032）0.914±0.1393）

傳統(tǒng)中醫(yī)多將SUI歸屬中醫(yī)“小便不禁”“膀胱咳”“遺尿”等范疇，臨床主要表現(xiàn)為小便排出異常，并認(rèn)為其病因病機(jī)與“氣”密切相關(guān)，而氣的生理功能主要依賴于脾腎二臟［9］?？s泉固尿方系我國現(xiàn)代著名中醫(yī)藥學(xué)家俞長榮教授治療尿失禁五十多年的經(jīng)驗(yàn)效方。俞老認(rèn)為，本病主要病因病機(jī)的形成與肺脾腎不足，氣攝無權(quán)，膀胱失約，開闔失常有關(guān)。氣有固攝之功，對人體津液有固護(hù)統(tǒng)攝和控制功能，若氣虛不攝津，則致小便失禁。另外，腎與膀胱相表里，腎的封藏、固攝、溫煦、氣化作用直接影響膀胱對人體尿液的貯藏與排泄功能。本病以肺脾腎虧虛、氣失固攝為本，膀胱失約為標(biāo)，法當(dāng)標(biāo)本同治。宗法隨證立、方從法出之則，縮泉固尿方由黃芪、補(bǔ)骨脂、西洋參、桑螵蛸、益智仁、熟地、甘草等中藥組成，具有補(bǔ)脾益腎，固孚縮尿之功。

本實(shí)驗(yàn)通過對各組實(shí)驗(yàn)大鼠陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA表達(dá)的分析，結(jié)果表明SUI模型鼠中陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA的表達(dá)均低于正常對照組，縮泉固尿方中、高劑量組較模型組 TGFβ-3 mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。證實(shí)TGFβ-3與SUI的發(fā)生具有相關(guān)性，而縮泉固尿方可能通過提高SUI模型鼠中陰道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA的表達(dá)對SUI產(chǎn)生治療作用，是其可能的作用機(jī)制之一。

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