p16、DAPK和APC基因甲基化在肺癌早期診斷中的價(jià)值▲

駱江龍 李 鯤 馮 旭

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021)

當(dāng)今世界肺癌的發(fā)病率仍然高居不下，文獻(xiàn)[1]顯示肺癌發(fā)病率在惡性腫瘤中已處于第一的位置，并且男性和女性的發(fā)病率都處于首位。發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家也沒有因?yàn)獒t(yī)療環(huán)境的差異而有所變化，死亡率可能不一樣，發(fā)病率大致差不多。預(yù)計(jì)到未來10年，肺癌在全世界仍將是新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤。目前肺癌的治療手段有很多種，包括常規(guī)的手術(shù)治療和放化療，近期的生物靶向治療也有所進(jìn)展。早期肺癌采取常規(guī)手術(shù)治療一般可起到根治的效果。但當(dāng)前肺癌治療效果較差，難以達(dá)到預(yù)期效果，這主要?dú)w因于早期肺癌并無明顯癥狀，且早期篩查手段診斷率不高，大部分在醫(yī)院就診的肺癌患者已發(fā)展到中晚期階段，并且晚期肺癌并沒有效果明顯的治療手段[1]。

肺癌的常規(guī)診斷技術(shù)是CT和X線等影像學(xué)手段，但是這些診療技術(shù)不利于鑒別肺癌的早期情況。近年來表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，讓我們可以將視角轉(zhuǎn)向分子和基因檢測等層面。早期檢測和鑒別患者基因分子的變化情況，可能將是未來早期診斷肺癌的有力手段。有證據(jù)表明[2]抑癌基因的異常甲基化是導(dǎo)致基因失活的一個(gè)重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)利用甲基化特異性PCR法分別檢測肺癌、肺良性病變患者血漿中p16、DAPK和APC基因的甲基化情況，分析啟動(dòng)子DNA甲基化介導(dǎo)的基因在肺癌中的沉默以及具有潛在危險(xiǎn)因素的無癌癥對(duì)照可能為肺癌的預(yù)測提供線索。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2015年6月至2016年10月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診，行手術(shù)治療且術(shù)后經(jīng)本院病理科檢測確診為非小細(xì)胞肺癌的患者79例為研究對(duì)象，其中男57例，女22例，年齡35～80歲，中位年齡63.27歲。按2015版WHO肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[3]：鱗癌37例，腺癌40例。按國際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[4]：Ⅰ、Ⅱ期29例，Ⅲ、Ⅳ期50例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的47例?；颊呔懦渌麗盒阅[瘤病史且未行化療或放療等其他治療。同時(shí)選擇廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科同年住院治療的40例肺部非惡性腫瘤患者為對(duì)照組，其中男28例，女12例，年齡19～78歲，中位年齡57.23歲。對(duì)照組均排除肺部或其他器官的惡性腫瘤病史，其中支氣管擴(kuò)張16例，支氣管肺炎9例，慢性阻塞性肺疾病(COPD)5例，肺結(jié)核4例，支氣管哮喘、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、自發(fā)性氣胸、胸腔積液、炎性假瘤及肺囊腫各1例。病例資料的收集均征得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 患者均于治療前抽取清晨空腹外周靜脈血2 mL，ACD抗凝，2 000 r/min離心15 min分離血漿，再以12 000 r/min離心15 min，獲得無血細(xì)胞成分的血漿，以1.5 mL試管分裝，于-80℃保存待檢測。

1.2.2 血漿DNA提取 采用天根生物科技有限公司(北京)的血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒，分別對(duì)肺癌組和對(duì)照組進(jìn)行基因組DNA提取，提取過程按照試劑盒說明操作。采用紫外線分光光度計(jì)測定純度和含量來判斷提取結(jié)果。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾 采用Epigentek公司的Methylamp Universal Methylated DNA Kit試劑盒進(jìn)行基因甲基化修飾，具體操作步驟按說明書。

1.2.4 MSP 參照文獻(xiàn)[5-6]設(shè)計(jì)p16基因、DAPK基因和APC基因引物，分別識(shí)別甲基化特異性序列(M) 和非甲基化特異性序列(U)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及MSP反應(yīng)條件見表1。PCR設(shè)計(jì)流程同文獻(xiàn)[5]。

1.3 甲基化判定標(biāo)準(zhǔn) PCR產(chǎn)物出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為基因甲基化；出現(xiàn)未甲基化條帶，而不出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為基因未甲基化；甲基化條帶和未甲基化條帶均出現(xiàn)的樣品，也判定為基因甲基化。

表1 MSP所用的引物序列及產(chǎn)物片斷長度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)；靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)；陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)；陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)[7]。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA甲基化檢測結(jié)果 p16、DAPK和APC基因啟動(dòng)子甲基化結(jié)果見圖1～圖3。肺癌組外周血標(biāo)本中p16、DAPK和APC基因啟動(dòng)子甲基化率分別為51.9%(41/79)、50.6%(40/79)、35.4%(28/79)，對(duì)照組患者外周血標(biāo)本中p16、DAPK和APC基因啟動(dòng)子甲基化率分別為2.5%(1/40)、5.0%(2/40)、2.5%(1/40)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MSP電泳結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 p16基因MSP產(chǎn)物凝膠電泳圖。Marker：DNA marker；M：甲基化條帶；U：未甲基化條帶；P1：甲基化陽性對(duì)照；P2：甲基化陰性對(duì)照；1-3：肺癌組織；4：空白對(duì)照。

圖2 DAPK基因MSP產(chǎn)物凝膠電泳圖。Marker：DNA marker； M：甲基化條帶；U：未甲基化條帶；P1：甲基化陽性對(duì)照；P2：甲基化陰性對(duì)照；1：空白對(duì)照；2-4：肺癌組織。

圖3 APC基因MSP產(chǎn)物凝膠電泳圖。Marker：DN A marker；M：甲基化條帶；U：未甲基化條帶；P1甲基化陽性對(duì)照；P2：甲基化陰性對(duì)照；1-3：肺癌組織；4：空白對(duì)照。

2.2 p16、DAPK和APC基因甲基化與臨床資料的分析 79例肺癌患者外周血中p16、DAPK和APC基因甲基化狀態(tài)與臨床資料的比較分析結(jié)果見表2。3個(gè)基因的甲基化率與肺癌患者性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)臨床特征方面均無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 外周血p16、DAPK和APC基因甲基化水平與肺癌患者臨床特征之間的關(guān)系

2.3 p16、DAPK和APC基因甲基化測定對(duì)肺癌的診斷效果 外周血p16、DAPK和APC基因甲基化的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值結(jié)果見表3。單個(gè)基因甲基化的靈敏度p16和DAPK基因相對(duì)更高、分別為51.9%、50.6%，APC基因比前兩者較低，為35.4%。但是3個(gè)基因的特異度差別不大，分別為97.5%、95.5%、97.5%。多個(gè)基因的聯(lián)合檢測肺癌可明顯提高靈敏度(73.4%)，但特異度有所下降(90%)。

表3 外周血p16、DAPK、APC基因甲基化的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值 (%)

3 討 論

當(dāng)前腫瘤臨床診斷研究的熱點(diǎn)主要在基因和蛋白兩個(gè)方面，通過血清學(xué)檢測基因和蛋白可初步鑒別腫瘤，但是大多數(shù)指標(biāo)的準(zhǔn)確率相對(duì)較低[8]，并且腫瘤的發(fā)展過程與多個(gè)因素有關(guān)，因此發(fā)現(xiàn)一個(gè)或者多個(gè)與腫瘤關(guān)系最密切的因子，對(duì)于惡性腫瘤的早期診斷和早期篩查具有顯著的指導(dǎo)作用。

p16基因定位于人類染色體9p21，由2個(gè)內(nèi)含子及3個(gè)外顯子組成。P16蛋白是p16基因編碼的細(xì)胞周期抑制性蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂和增殖。Yan等[9]薈萃分析表明p16基因在肺癌患者中發(fā)生甲基化現(xiàn)象非常普遍，基因的甲基化發(fā)生在肺癌形成早期階段，并且具有高度的特異性和低度的敏感性。彭再梅等[10]研究表明p16基因的異常甲基化與患者的臨床特征無相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)佐證了p16基因甲基化現(xiàn)象在肺癌早期就已經(jīng)出現(xiàn)，有望成為肺癌早期診斷的指標(biāo)之一。

DAPK基因定位于人類染色體 9q34.1，可參與調(diào)控多種細(xì)胞生理過程，與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。Tang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，相比于未甲基化的肺癌患者，DAPK基因異常甲基化顯著降低了肺癌患者的5年存活率。國外研究顯示，DAPK可能是克服對(duì)抗EGFR藥物抗性以提高治療效果的新靶點(diǎn)，DAPK甲基化有作為藥物反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物的可能[13-14]。本研究也顯示了DAPK基因異常甲基化和肺癌的相關(guān)性。

APC基因位于人類染色體5q21，含21個(gè)外顯子，該基因有控制細(xì)胞的死亡或成長的功能，可以有效控制細(xì)胞的數(shù)量。Schneikert等[15]研究表明，APC基因啟動(dòng)子異常甲基化不僅僅是肺癌患者的孤立現(xiàn)象，還出現(xiàn)在其他腫瘤，如結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等。Feng等[16]的研究表明，APC基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤患者臨床特征有關(guān)聯(lián)的主要是腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和吸煙；而本研究中APC基因甲基化與性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床資料均無相關(guān)性，這可能與研究中樣本和研究方法的差異有關(guān)。Huang等[17]對(duì)151項(xiàng)研究行薈萃分析提示，APC基因是鑒別鱗癌和腺癌的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究未發(fā)現(xiàn)APC基因甲基化在鱗癌和腺癌之間的差異，也許需要進(jìn)一步的研究。

本研究中，對(duì)肺癌患者血漿中3個(gè)基因的甲基化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單個(gè)檢測結(jié)果靈敏度分別為51.9%(41/79)、50.6%(40/79)、35.4%(28/79)，雙項(xiàng)聯(lián)合檢測靈敏度為62.0%(49/79)、69.3%(50/79)、59.5%(47/79)，三項(xiàng)聯(lián)合檢測靈敏度為73.4%(58/79)，隨著檢測項(xiàng)目的增多，聯(lián)合檢測可明顯提高靈敏度，但是特異度卻有所下降。這表明多個(gè)項(xiàng)目聯(lián)合檢測可有助于患者門診的篩查。

綜上所述，p16、DAPKA和APC基因啟動(dòng)子的異常甲基化伴隨著肺癌的產(chǎn)生和發(fā)展，在肺癌的早期階段均已出現(xiàn)，都有望成為肺癌早期診斷的指標(biāo)。值得注意的是，肺良性疾患組中均出現(xiàn)了p16、DAPK和APC基因的異常甲基化，是否是肺癌發(fā)生的預(yù)兆，這需要下一步的研究證明。今后，我們將找尋更多的可以在肺癌診斷中發(fā)揮作用的因子，并對(duì)比各因子的檢測費(fèi)用和準(zhǔn)確率，從中選出最好的并且適合推廣的常規(guī)檢測手段。

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