參松養(yǎng)心膠囊對心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

張敬 馮紅兵 李君 羅長軍 熊小奇

[摘要]目的探究參松養(yǎng)心膠囊對心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制研究。方法

采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)建立心肌梗死模型。將60只SD大鼠隨機(jī)分為梗死組與非梗死組，非梗死組采取開胸后冠狀動(dòng)脈穿線，但不做結(jié)扎。模型制作成功后，將兩組隨機(jī)平分為對照組10只，美托洛爾組10只，參松養(yǎng)心膠囊組10只，術(shù)后分別以普食、普食+美托洛爾、普食+參松養(yǎng)心膠囊原粉喂食。8周后處理大鼠，取心肌梗死周圍組織，檢測各組大鼠心肌縫隙連接蛋白（Cx43）和信使RNA（rnRNA）的表達(dá)量。結(jié)果在非梗死各組中Cx43蛋白表達(dá)強(qiáng)烈，且均勻的分布在細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接處；與非梗死組比較，梗死組的對照組Cx43表達(dá)明顯減弱，甚至全部消失，而參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組梗死區(qū)的Cx43表達(dá)減弱和分布的紊亂彌散程度均較??；非梗死各組的蛋白和mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在梗死組中，對照組Cx43蛋白和mRNA表達(dá)明顯低于參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組（P<0.05），但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論參松養(yǎng)心膠囊能夠顯著改善大鼠心肌梗死后Cx43的表達(dá)，可能與其報(bào)道中能改善心肌梗死后心律失常和心功能不全有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]心肌梗死；參松養(yǎng)心膠囊；美托洛爾；縫隙連接蛋白

心肌梗死是臨床上常見的心臟疾病，多數(shù)患者常常會(huì)伴有心率失常，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)心室顫動(dòng)進(jìn)而導(dǎo)致猝死。因此心臟梗死嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，危害生命。但是目前臨床上常見的抗心律失常的藥物在改善患者心律失常的同時(shí)，會(huì)出現(xiàn)很多并發(fā)癥導(dǎo)致死亡率的增加。因此尋找一種能夠改善患者心律失常同時(shí)，增強(qiáng)療效，改善患者預(yù)后，減少患者的死亡率的藥物至關(guān)重要。參松養(yǎng)心膠囊由五味子、麥冬、丹參、黃連等多種中藥組成的復(fù)方劑。有研究發(fā)現(xiàn)，參松養(yǎng)心膠囊能夠通過抑制離子通道來改善心律失常，并且預(yù)后良好，減少了病死率和死亡率。但是具體的作用機(jī)制尚不清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白43（eonnexin43，Cx43）在室性心律失常發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。因此本文建立心肌梗死的模型來研究參松養(yǎng)心膠囊治療對Cx43表達(dá)的影響及可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料：雄性SD大鼠60只，體重250～300g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Cx43單克隆抗體和辣根酶標(biāo)記二抗購自美國Abcaln公司；DAB顯色試劑盒，蘇木素購自北京中杉金橋公司；Trizol Reagent購自Invit.mgen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒均購自ThermoFisher Scientific公司，參松養(yǎng)心膠囊購自北京以嶺藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字Z20103032，產(chǎn)品批號20160781），酒石酸美托洛爾片購自阿斯利康制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字H32025392，產(chǎn)品批號20153302L）。

1.2動(dòng)物模型的建立及分組：取60只sD大鼠，隨機(jī)分為非心肌梗死組30只與心肌梗死組30只。梗死組以戊巴比妥（30mg/kg）耳緣靜脈麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。非梗死組采取假手術(shù)，以戊巴比妥（30me_/kg）麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟后在冠狀動(dòng)脈下穿線，但不結(jié)扎。以心電監(jiān)護(hù)檢測顯示I、Ⅱ、aVL導(dǎo)聯(lián)sT段抬高0.2mv以模型建造成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，將梗死組與非梗死組分別隨機(jī)分為三組（分別為對照組10只，美托洛爾組10只，參松養(yǎng)心膠囊組10只），各以普食（對照組），普食+美托洛爾（美托洛爾劑量0.5g/kg·d），普食+參松養(yǎng)心膠囊（參松養(yǎng)心膠囊原粉0.8g/kg·d）喂養(yǎng)8周后，處死動(dòng)物，取心肌梗死周圍組織。

1.3觀察指標(biāo)：

1.3.1心肌細(xì)胞中Cx43的檢測：將取出的心臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，包埋后連續(xù)切片，切片厚度控制在4t_tm，采用免疫組織化學(xué)sP法檢測心臟心肌細(xì)胞中Cx43的表達(dá)。染色步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書。一抗Cx43（1：300）4℃過夜，DAB染色，蘇木素復(fù)染，分化。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為實(shí)驗(yàn)的陰性對照。在400倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，用Image J軟件分析圖片的平均陽性表達(dá)面積與積分光密度值。

1.3.2 western blot技術(shù)方法檢測心肌細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)：取心臟組織，按照RAPI裂解液說明書提取細(xì)胞中的總蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法對總蛋白進(jìn)行定量。取30μg總蛋白采用10%SDS-PAGE分離蛋白，電泳1.5小時(shí)后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加鼠抗Cx43單克隆抗體（1：2000）4℃過夜，PBS清洗后加入二抗[IgG1：2000）]，37℃孵育2h，最后電化學(xué)發(fā)光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）測蛋白條帶光密度值。本實(shí)驗(yàn)選用GAPDH作為內(nèi)參對照。以Cx43與GAPDH蛋白的光密度值的比值作為Cx43的相對表達(dá)量。

1.3.3 RT-PCR技術(shù)方法檢測心肌細(xì)胞中Cx43mRNA的表達(dá)：取心臟組織，采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞中的RNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒說明書操作，將細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成eDNA，然后擴(kuò)增成DNA。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS22.0版數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析比較組間差異性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況：各組動(dòng)物均無死亡、飲食異常和腹瀉等情況，按原定計(jì)劃后處死取目標(biāo)組織。

2.2 Cx43免疫組化染色結(jié)果：在非梗死組，各組Cx43蛋白表達(dá)強(qiáng)烈，且均勻的分布在細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接處?？梢娝鼈兂首攸S色顆粒狀表達(dá)，主要位于閏盤內(nèi)，成線狀排列，與細(xì)胞長軸方向垂直。與之比較，在各梗死組Cx43表達(dá)明顯減弱且分布紊亂。尤其在梗死組，對照組的Cx43表達(dá)明顯減弱，甚至全部消失，而參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組梗死區(qū)的Cx43表達(dá)減弱和分布的紊亂彌散程度均較?。▓D1、圖2見封三）。

2.3 Cx43免疫組化結(jié)果分析：圖象定量分析顯示在梗死組，與對照組相比，參松養(yǎng)心膠囊組和美托洛爾組Cx43陽性表達(dá)面積明顯升高（2532.70±282.70）vs（1421.70±326.50）（P<0.05）和（2842.50±336.50）vs（1421.70±326.50）（P<0.05）。同樣兩組測定的積分光密度值也明顯高于對照組（399.24±66.54）vs（223.74±42.15）（P<0.05）和（436.74±78.29）vs（223.74±42.15）（P<0.05）。但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖象定量分析顯示在非梗死組，三者之間的Cx43陽性表達(dá)面積和積分光密度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 Western blot結(jié)果分析：在非梗死組各組的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在梗死組中對照組Cx43表達(dá)明顯低于參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組（0.31±0.12）units vs（1.50±0.21）units（P<0.05）和（0.31±0.12）units vs（1.39±0.16）units（P<0.05），但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.5RT-PCR結(jié)果分析：在非梗死組，各組的Cx43mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。但在梗死組中對照組Cx43mRNA表達(dá)明顯低于參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組（0.29±0.09）units vs（0.56+0.12）units（P<0.05）和（0.29+0.09）units vs（0.57±0.14）tmits（P<0.05），而參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

Cx43是心室肌縫隙連接通道的主要構(gòu)成成分，參與著細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心肌細(xì)胞中的連接蛋白Cx43會(huì)發(fā)生數(shù)量，分布等方面的顯著改變。在Peter等的研究中報(bào)道，在構(gòu)建的心肌梗死的犬模型中發(fā)現(xiàn)心外膜梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞的Cx43數(shù)量顯著降低，而且分布也發(fā)生了顯著的變化；而在離心肌梗死稍遠(yuǎn)區(qū)的心肌細(xì)胞的Cx43分布未見明顯變化，但是其數(shù)量卻又顯著地降低。而本研究結(jié)果顯示在非梗死組，各組Cx43蛋白表達(dá)強(qiáng)烈，且均勻地分布在細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接處?？梢娝麄兂首攸S色顆粒狀表達(dá)，主要位于閏盤內(nèi)，成線狀排列，與細(xì)胞長軸方向垂直。與之比較，在梗死組各組Cx43表達(dá)明顯減弱且分布紊亂。尤其在對照組，梗死區(qū)的Cx43表達(dá)明顯減弱，甚至全部消失，而參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組梗死區(qū)的Cx43表達(dá)減弱和分布的紊亂彌散程度均較小，與國內(nèi)外的研究報(bào)道一致。

Cx43是構(gòu)成心室肌細(xì)胞間縫隙連接（gap june.tion，GJ）通道最主要的蛋白，也是心室肌細(xì)胞間電流傳導(dǎo)的主要導(dǎo)體。有研究報(bào)道，縫隙連接的連接蛋白43是冠狀動(dòng)脈阻塞后心肌梗死范圍大小的最主要的決定因素之一。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)梗死組的Cx43蛋白的表達(dá)明顯高于非梗死組，經(jīng)美托洛爾和參松養(yǎng)心膠囊藥物干預(yù)后，心肌細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的降低。在梗死組，與對照組相比，參松養(yǎng)心膠囊組和美托洛爾組Cx43陽性表達(dá)面積明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同樣兩組測定的積分光密度值也明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而在非梗死組，三者之間的Cx43陽性表達(dá)面積和積分光密度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示美托洛爾與參松養(yǎng)心膠囊兩藥均能改善心肌梗死后心律失常和心功能不全。

Lindsey等的研究報(bào)道在心肌梗死的小鼠模型的心肌連接蛋白Cx43的陽性表達(dá)面積明顯減少，而且Cx43蛋白的表達(dá)水平也比對照組有明顯的降低，但是Cx43rnRNA的表達(dá)卻未見明顯的改變。本研究結(jié)構(gòu)顯示，與對照組相比，SD大鼠心肌梗死模型中心肌連接蛋白Cx43的陽性表達(dá)和Cx43mRNA，蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)了明顯的改變（P<0.05），該結(jié)果與Amino等的研究一致，在大鼠心肌梗死后心肌連接蛋白Cx43的分布與mRNA和蛋白的水平明顯減少（P<0.05），提示心肌細(xì)胞梗死后心肌連接蛋白發(fā)生了重構(gòu)現(xiàn)象。在經(jīng)美托洛爾和參松養(yǎng)心膠囊藥物治療后，心肌細(xì)胞中的心肌連接蛋白的mRNA和蛋白的水平出現(xiàn)了明顯的升高，提示美托洛爾和參松養(yǎng)心膠囊兩藥均能夠通過調(diào)節(jié)心肌連接蛋白Cx43的表達(dá)來發(fā)揮改善心肌梗死后心臟重構(gòu)的作用。但是與美托洛爾相比，參松養(yǎng)心膠囊對Cx43的調(diào)節(jié)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

因此，通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推斷，參松養(yǎng)心膠囊能夠通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中心肌連接蛋白Cx43的表達(dá)來延緩心肌梗死后心臟重構(gòu)的病理變化，其作用和美托洛爾相當(dāng)。但是關(guān)于具體的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。