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    石油烴高效降解菌的篩選、復(fù)配及降解條件優(yōu)化

    2020-12-23 12:27:34段濰超楊澤群劉其友
    化學(xué)與生物工程 2020年12期
    關(guān)鍵詞:石蠟甲苯氮磷

    段濰超,楊澤群,劉其友

    (1.青島歐賽斯環(huán)境與安全技術(shù)有限責(zé)任公司,山東 青島 266555; 2.中國石油大學(xué)(華東),山東 青島 266555)

    石油是目前人類使用最為廣泛的能源之一,但在開采、儲運(yùn)、煉制及加工過程中,石油因事故、泄漏或排污等不可避免的會進(jìn)入水體和土壤中,從而污染生態(tài)環(huán)境[1-3]。相較于物理法和化學(xué)法,微生物法可將烴類物質(zhì)礦化成H2O、CO2及其它無毒物質(zhì),且由于投資少和能耗低等優(yōu)勢,已成為石油污染修復(fù)技術(shù)的發(fā)展趨勢[4]。自然界中廣泛存在著許多能夠降解石油的微生物[5]。謝丹平等[6]分離得到了可降解C12~C22直鏈烷烴的芽孢桿菌屬菌株和鄰單胞菌屬菌株;李寶明等[7]成功篩選到1株高效降解芳香烴的蒼白桿菌屬菌株和2株高效降解直鏈烷烴的紅球菌屬菌株;Roy等[8]則分離到5株對阿拉伯混合原油降解率達(dá)47%~78%的石油降解菌。隨著篩選技術(shù)的發(fā)展,石油烴高效降解菌會不斷被篩選出,但在大多數(shù)情況下,單一菌株對石油烴的降解能力仍然有限,若通過構(gòu)建復(fù)配菌群、利用微生物間的協(xié)同作用,可極大提高微生物降解石油烴的能力。謝丹平[9]通過復(fù)配實(shí)驗(yàn)確定了4種石油烴高效降解菌株的最優(yōu)菌液接種量;張秀霞等[10]研究了復(fù)配微生物降解石油烴的最優(yōu)pH值和接種量;馬強(qiáng)[11]研究了復(fù)配微生物降解石油烴的最優(yōu)pH值和溫度。

    作者基于原油組成選取模式物,從實(shí)驗(yàn)室保存的石油烴降解菌株中篩選各模式物的高效降解菌株,并對高效降解菌株的復(fù)配進(jìn)行優(yōu)化,通過正交實(shí)驗(yàn)確定復(fù)配菌群的最優(yōu)降解條件。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 菌株與儀器

    菌株S1、S2、S3、S4、S5和S6,實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。

    BCM-1000型生物凈化工作臺,凈化設(shè)備有限公司;LDZM型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;HZQ-QX型全溫振蕩器、HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;GILSON型移液槍,上海華運(yùn)分析儀器有限公司;Scout Pro型分析天平,奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;SPX-250B型生化培養(yǎng)箱,上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;UV-2100型紫外分光光度計(jì),上海昂拉儀器有限公司;KDN-08C型消化爐、ATN-300型全自動凱氏定氮儀,上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇金怡儀器科技有限公司。

    1.2 菌株活化和篩選

    菌株活化:在250 mL錐形瓶中,配制100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g或5 g,蛋白胨10 g,蒸餾水1 000 mL,NaCl 5 g,pH值7.0~7.2),經(jīng)立式壓力蒸汽滅菌器滅菌,冷卻至室溫;接種2 mL原始菌液至培養(yǎng)基中,置于恒溫振蕩器,30 ℃、160 r·min-1持續(xù)振蕩48 h。

    菌株篩選:在250 mL錐形瓶中,配制100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基[(NH4)2SO41.0 g,K2HPO41.0 g,CaCl20.02 g,NaCl 10 g,KH2PO41.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,F(xiàn)eCl3痕量,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0],經(jīng)立式壓力蒸汽滅菌器滅菌,冷卻至室溫后置于生物凈化工作臺上,分別加入一定量的甲苯(1 mL)、菲(0.2 g)、石蠟(3 g)和原油(0.1 g);無菌操作取出已活化菌株S1、S2、S3、S4、S5和S6,各接種2 mL菌液至培養(yǎng)基中,置于恒溫振蕩器,30 ℃、160 r·min-1持續(xù)振蕩5 d。

    1.3 降解率的測定

    將模式物甲苯、菲和原油分別溶于一定量的石油醚中,配成標(biāo)準(zhǔn)儲備液;分別取一系列不同量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用石油醚定容,得到不同梯度濃度的模式物溶液;用紫外分光光度計(jì)測定溶液吸光度(甲苯、菲和原油的最大吸收波長分別為242 nm、211 nm和225 nm),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(表1)進(jìn)行濃度標(biāo)定,分別計(jì)算甲苯、菲和原油的降解率。

    表1 甲苯、菲和原油的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

    模式物石蠟的質(zhì)量標(biāo)定采用稱重法:將降解后含固體石蠟的搖瓶從恒溫振蕩器中取出,將培養(yǎng)液過濾后風(fēng)干,稱重并記錄剩余石蠟質(zhì)量,按下式計(jì)算石蠟降解率(D,%):

    式中:M為降解前石蠟質(zhì)量,g;M0為降解后石蠟質(zhì)量,g。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 石油烴高效降解菌株的篩選

    2.1.1 單一菌株對甲苯、菲、石蠟的降解率

    菌株S1~S6對模式物甲苯、菲和石蠟的降解率如圖1所示。

    由圖1可知,對于模式物甲苯,菌株S2和S5的降解率最高,分別達(dá)到了44.44%和39.23%,可參與后期菌株復(fù)配;對于模式物菲,菌株S1和S6的降解率最高,分別達(dá)到了41.80%和39.68%,可參與后期菌株復(fù)配;對于模式物石蠟,菌株S1~S6的降解率均不超過5%,其中S4對石蠟的降解率最高(4.41%),可參與后期菌株復(fù)配。

    圖1 菌株S1~S6對模式物甲苯、菲和石蠟的降解率Fig.1 Degradation rate of toluene,phenanthrene,and paraffin wax by strains S1-S6

    2.1.2 單一菌株對原油的降解率

    菌株S1~S6對原油的降解率如圖2所示。

    圖2 菌株S1~S6對原油的降解率Fig.2 Degradation rate of crude oil by strains S1-S6

    由圖2可知,菌株S1~S6對原油的降解率均不超過20%,分別為18.50%、12.44%、12.66%、10.55%、12.58%、10.50%。除菌株S1略高外,菌株S2~S6對原油的降解率相差不大。

    2.2 石油烴高效降解菌株的復(fù)配

    基于單一菌株對模式物的降解率,選擇菌株S1、S2、S4、S5、S6經(jīng)不同方式組合得到石油烴高效降解菌株復(fù)配菌群A、B、C、D(表2)。將4種復(fù)配菌群分別接種至含原油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,5 d后,測定4種復(fù)配菌群對原油的降解率,結(jié)果如圖3所示。

    由圖3可知,復(fù)配菌群A、B、C、D對原油的降解率分別為28.74%、21.71%、22.47%、24.26%,明顯高于單一菌株對原油的降解率。其中,復(fù)配菌群A(S1+S2+S4)對原油的降解率最高,這是因?yàn)?種單一菌株S1、S2、S4分別對多環(huán)芳烴、單環(huán)芳烴、長鏈烷烴具有較好的降解效果,復(fù)配后,通過協(xié)同作用可以獲得更高的原油降解率。因此,選取復(fù)配菌群A 進(jìn)行后續(xù)的降解條件優(yōu)化研究。

    表2 4種復(fù)配菌群的組成

    圖3 4種復(fù)配菌群對原油的降解率Fig.3 Degradation rate of crude oil by four compound bacteria

    2.3 復(fù)配菌群A對原油的降解條件優(yōu)化

    選擇pH值、底物濃度、氮磷比、接種量和溫度為考察因素,以原油降解率為指標(biāo),采用5因素5水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配菌群A對原油的降解條件,結(jié)果見表3。

    由表3可知,在25組實(shí)驗(yàn)中,復(fù)配菌群A對原油的降解率最高可達(dá)37.52%(12#實(shí)驗(yàn)),相應(yīng)的降解條件為:pH值7、底物濃度0.4 g·L-1、氮磷比7∶1、接種量1 mL、溫度30 ℃;5種因素對原油降解率的影響大小為:pH值>溫度>底物濃度>接種量>氮磷比,其中pH值對原油降解率的影響最大,溫度次之,氮磷比影響最小,這可能是由于復(fù)配菌群A內(nèi)的原油分解酶對pH值較為敏感所致。

    3 結(jié)論

    對實(shí)驗(yàn)室保存的6株石油烴降解菌S1~S6進(jìn)行活化,然后以甲苯、菲、石蠟為模式物,考察單一菌株對模式物的降解效果,發(fā)現(xiàn)對單環(huán)芳烴(甲苯)降解效果最好的是S2和S5,對多環(huán)芳烴(菲)降解效果最好的是S1和S6,對長鏈烷烴(石蠟)降解效果最好的是S4。將S1、S2、S4復(fù)配得到的復(fù)配菌群對原油的降解效果最好,其最優(yōu)降解條件為:pH值7、底物濃度0.4 g·L-1、氮磷比7∶1、接種量1 mL、溫度30 ℃,各因素對原油降解率的影響大小為:pH值>溫度>底物濃度>接種量>氮磷比。

    表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

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