綿羊肺炎支原體P208蛋白質(zhì)的分子特征分析及免疫原性

管禮麟， 馬 媛， 楊丹茹， 楊發(fā)龍

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)是引起綿羊、山羊以及小反芻野生動(dòng)物非典型肺炎的重要病原[1-4]。此外，羊感染綿羊肺炎支原體后，對(duì)其他病原的易感性增加[5]。該病原在世界多個(gè)國家及地區(qū)均有分布，在中國多個(gè)地區(qū)流行也十分廣泛，給養(yǎng)羊業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[6-8]。

研究結(jié)果表明，綿羊肺炎支原體與引起豬地方流行性肺炎的病原豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae， Mhp)具有最為相近的親緣關(guān)系[9-10]。目前對(duì)豬肺炎支原體的毒力因子及重要功能蛋白進(jìn)行了較為深入的研究，特別是黏附相關(guān)分子和免疫原蛋白[11-12]。其中由mhp493基因(p216基因)編碼的P216蛋白，不僅參與豬肺炎支原體對(duì)細(xì)胞的黏附，也證明是重要的免疫原之一，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體[13-14]。在對(duì)綿羊肺炎支原體SC01全基因組[14]進(jìn)行分析的過程中，發(fā)現(xiàn)1個(gè)與豬肺炎支原體p216高度同源的基因，其編碼蛋白的分子量預(yù)測(cè)為208 400，故暫命名為p208基因，編碼蛋白命名為P208蛋白。但目前對(duì)該蛋白分子特征以及免疫原特性尚不清楚。因此本研究對(duì)p208基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，并分析其免疫原性，旨在為下一步深入研究其結(jié)構(gòu)及功能以及為其在亞單位疫苗和血清學(xué)診斷中作為抗原的可能性提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 菌株、載體及血清

綿羊肺炎支原體SC01株由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存。pET-32a(+)載體為Novagen公司產(chǎn)品。大腸桿菌E.coilDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自北京天恩澤基因科技有限公司。山羊抗綿羊肺炎支原體SC01株陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG購自Abbkine公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI和T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。金牌 Mix(green) Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1x)為北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Gel Extraction Kit、Plasmid Miniprep Kit均為Omega公司產(chǎn)品。HistrapTM蛋白純化柱為GE Healthcare公司產(chǎn)品。SuperLumia ECL HRP Substrate Kit為Abbkine公司產(chǎn)品。

1.3 p208基因序列分析

采用NCBI的BLAST工具及DNAStar軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列的同源性比較和分析,同時(shí)進(jìn)行核苷酸和氨基酸的比對(duì)及分析。采用TMHMM、SignalP4.1、LipoP1.0等在線軟件對(duì)P208蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽、脂蛋白及抗原性及理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)綿羊肺炎支原體SC01株p208基因序列(Accession: AFHO01000009.1)，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)引物P208F和P208R，其序列為：P208F: 5′-CGCGGATCCGAAGATGCCCTTGCCAGTCT-3′(下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))；P208R: 5′-CCGCTCGAGCAGATGCTGAACCACCTTGGT-3′(下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))。這對(duì)引物擴(kuò)增的片段大小為676 bp(從第1 498 bp至2 173 bp)，該片段編碼的P208蛋白從第500位至第725位氨基酸，該區(qū)域不含有在支原體中編碼色氨酸的TGA密碼子，且含有豐富的抗原表位。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 目的片段的PCR擴(kuò)增

采用酚/氯仿法提取綿羊肺炎支原體SC01株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中需添加的模板，利用上述引物P208F/P208R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為20 μl，包括金牌 Mix(green) Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1x) (5 U/μl)10 μl、上下游引物(10 U/L)各1 μl、DNA模板2 μl以及雙蒸水6 μl。反應(yīng)條件為：首先94 ℃預(yù)變性4 min；然后94 ℃變性45 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存并結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用Gel Extraction Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收。分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI對(duì)純化的目的片段和pET-32a(+)空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后，采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨后均勻涂布至含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。挑取陽性菌落，接種至含有100 μg/ml 氨芐青霉素的LB肉湯中，37 ℃ 160 r/min水平搖床培養(yǎng)過夜后離心收集菌體，采用Plasmid Miniprep Kit按試劑盒操作說明提取質(zhì)粒。通過PCR擴(kuò)增對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并將陽性克隆交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。將重組表達(dá)載體命名為pET-32a(+)-P208。由其編碼表達(dá)的重組蛋白命名為rP208。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析及純化

將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒pET-32a(+)-P208轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌E.coliBL21(DE3)中，均勻涂布于含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)陽性菌落接種至含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯中，37 ℃ 160 r/min水平振蕩培養(yǎng)過夜。取500 μl培養(yǎng)菌液接種至50 ml含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6后，加入0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，隨后8 000 r/min離心15 min，棄去上清液，加入適量PBS重懸菌體沉淀后，同條件再次離心，收集菌體沉淀，加入10 ml PBS重懸后，采用超聲破碎儀在冰浴條件下進(jìn)行超聲裂解。破碎完成后8 000 r/min 4 ℃離心30 min，分別收取上清液和沉淀，沉淀加入5 ml PBS(0.01 mol/L，pH7.4)重懸。利用SDS-PAGE電泳對(duì)沉淀和上清液中的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，鑒定其可溶性。根據(jù)可溶性結(jié)果，使用GE公司HistrapTMHP純化柱按照說明書對(duì)重組蛋白質(zhì)rP208進(jìn)行純化。

1.8 Western blot分析

用純化的rP208蛋白質(zhì)制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。50 g/L脫脂奶粉溶液封閉過夜，TBST洗滌3次(每次10 min)后以1∶100稀釋的山羊抗綿羊肺炎支原體SC01株陽性血清為一抗孵育2 h，同法洗滌后孵育二抗2 h，二抗為1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG，最后洗滌完畢后，加入SuperLumia ECL HRP Substrate Kit發(fā)光劑，于Versa Doc成像系統(tǒng)成像。以綿羊肺炎支原體抗體陰性的山羊血清作為對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 p208基因及其編碼蛋白質(zhì)的分子特征分析

2.1.1 同源性分析 經(jīng)BLAST比較分析，綿羊肺炎支原體p208基因僅與豬肺炎支原體p216(GenBank: AF541877.1)、編碼殊異支原體細(xì)胞表面蛋白基因(MDIS-02775)(GenBank:CP007229.1)以及編碼豬絮狀支原體P97/LPPS家族蛋白基因(MYF-00960)(GenBank: CP007585.1)之間具有較高的相似性。經(jīng)DNAStar軟件進(jìn)行比對(duì)分析(表1)發(fā)現(xiàn)，綿羊肺炎支原體p208基因與編碼殊異支原體細(xì)胞表面蛋白基因相似性最高，兩者核苷酸序列相似性為58.6%，與豬肺炎支原體p216基因及編碼豬絮狀支原體P97/LPPS家族蛋白基因核苷酸序列相似性均為56.2%，。因此可推測(cè)上述4個(gè)基因?yàn)橹毕低椿颉?/p>

2.1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 P208蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為208 401，理論等電點(diǎn)為5.5。原子總數(shù)為29 158，原子組成為C: 9 249；H: 14 513；N: 2 457；O: 2 911；S: 11；Se: 17，分子式為C9249H14513N2457O2911S11Se17。其中，Ser(9.7%)、Leu(9.3%)、Lys(8.1%)、Asp(7.3%)、Gln(7.0%)、Asn(7.0%)等含量較高，而Seu(0.9%)、Met(0.6%)、Trp(0.3%)等含量相對(duì)較低。不穩(wěn)定系數(shù)為39.61，是一個(gè)穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

表1p208核苷酸同源性分析

Table1Thehomologyanalysisofp208nucleotide

基因1234165.258.664.9256.265.7356.24

1:編碼殊異支原體細(xì)胞表面蛋白基因MDIS-02775；2：豬肺炎支原體p216；3：綿羊肺炎支原體p208；4：編碼豬絮狀支原體P97/LPPS家族蛋白基因MYF-00960。

2.1.3 跨膜區(qū)及信號(hào)肽分析 根據(jù)P208蛋白的蛋白質(zhì)信號(hào)肽的分析以及蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果(圖1)分析可知，P208蛋白不含脂蛋白信號(hào)肽成分，其氨基酸序列中第1～18個(gè)氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)部，第19～41個(gè)氨基酸間形成1個(gè)明顯的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，第42～1 853氨基酸則位于細(xì)胞膜外側(cè)，即P208蛋白主要位于細(xì)胞膜外側(cè)。

圖1 P208蛋白跨膜區(qū)分布Fig.1 Transmembrane region distribution of P208 protein

2.1.4 抗原表位分析 在線分析抗原表位，結(jié)果(圖2)表明，P208蛋白可能含有69個(gè)抗原表位，平均抗原趨向性為1.020 8，其中第 157～180位氨基酸形成的表位抗原指數(shù)最高，其氨基酸序列為TKSIYLSVVDAPKAALAQFSDIVD。

圖2 P208蛋白抗原表位分布Fig.2 Antigenic epitopes distribution of P208 protein

2.2 p208基因片段的PCR擴(kuò)增

使用特異性引物P208F/P208R,以綿羊肺炎支原體SC01株DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，在700 bp左右出現(xiàn)了特異性條帶，該片段與預(yù)期中目的條帶的大小(676 bp)相符，陰性對(duì)照沒有出現(xiàn)擴(kuò)增(圖3)。

M:DNA markerⅡ；1： 綿羊肺炎支原體SC01株基因組DNA；2: 陰性對(duì)照。圖3 p208基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of p208 fragment

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

PCR產(chǎn)物連接至pET-32a(+)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽性克隆后，以提取的重組質(zhì)粒為模板，采用P208F/P208R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得條帶與預(yù)期相符(圖4)。對(duì)PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，目的片段的序列及大小與綿羊肺炎支原體SC01株p208基因相應(yīng)區(qū)域完全相同。

M：DNA markerⅡ；1：綿羊肺炎支原體SC01株基因組DNA；2～5：重組質(zhì)粒；6：陰性對(duì)照。圖4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.4 重組蛋白的表達(dá)、可溶性分析及純化

將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-p208轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在不同時(shí)間點(diǎn)收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示，重組表達(dá)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)蛋白的條帶大小與預(yù)期(36 500)相符，表明目的片段以融合蛋白質(zhì)的形式得到了表達(dá)。

為分析重組蛋白質(zhì)的可溶性，分別對(duì)全菌裂解物上清液及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)主要存在于上清液中，表明該蛋白質(zhì)以可溶性形式進(jìn)行表達(dá)。利用HistrapTMHP純化柱對(duì)重組P208蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果可知，在36 500左右處出現(xiàn)明顯條帶(圖5)，說明純化效果良好。

M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：上清液；2：沉淀；3：純化產(chǎn)物。圖5 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析及純化Fig.5 Solubility analysis and purification of rP208

2.5 重組蛋白Western-blot分析

以純化P208蛋白制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，利用山羊抗綿羊肺炎支原體高免血清為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG為二抗進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果(圖6)表明，經(jīng)純化后的重組蛋白與山羊抗綿羊肺炎支原體全菌抗體結(jié)合。表明P208蛋白具有良好的免疫原性。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化的重組蛋白rP208+陽性血清；2：純化的重組蛋白rP208+陰性血清。圖6 P208純化重組蛋白的Western-blot分析Fig.6 Western-blot analysis of P208 purified recombinant protein

3 討 論

綿羊肺炎支原體作為感染小反芻動(dòng)物的呼吸道病原，隨著養(yǎng)羊業(yè)從傳統(tǒng)的放養(yǎng)向集約化、規(guī)模化的圈養(yǎng)等飼養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，其危害越來越嚴(yán)重。但是，對(duì)于該病原的致病機(jī)制、毒力因子的研究相對(duì)較少，而且也沒有在臨床上普遍使用的血清學(xué)診斷試劑和疫苗。因此，深入研究該病原的分子生物學(xué)特征，對(duì)于揭示其致病機(jī)制以及開發(fā)診斷試劑和疫苗均非常重要。

黏附素是支原體重要的毒力因子，同時(shí)也往往是良好的免疫原分子。在綿羊肺炎支原體中，目前尚無確定的黏附素蛋白。在我們前期的研究中，在對(duì)綿羊肺炎支原體全基因組進(jìn)行測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)可能的黏附素分子進(jìn)行了預(yù)測(cè)[15]，并對(duì)P113[16-17]，P109[18]，P128[19]，P108[20]等的分子特征和免疫原性進(jìn)行了研究。為進(jìn)一步豐富對(duì)綿羊肺炎支原體黏附分子及免疫原蛋白的認(rèn)識(shí)，本研究對(duì)綿羊肺炎支原體P208蛋白的生物信息學(xué)進(jìn)行了分析。同源性比較分析發(fā)現(xiàn)，p208基因與豬肺炎支原體黏附素p216基因、編碼殊異支原體細(xì)胞表面蛋白基因以及編碼豬絮狀支原體P97/LPPS家族蛋白基因具有較高的同源性。其中針對(duì)殊異支原體細(xì)胞表面蛋白及豬絮狀支原體P97/LPPS家族蛋白的免疫原功能無相關(guān)研究報(bào)道,而針對(duì)豬肺炎支原體P216蛋白，研究結(jié)果表明其不僅參與豬肺炎支原體的黏附過程，同時(shí)也可以在體內(nèi)得到表達(dá)[21]，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，是一個(gè)良好的免疫原。

因此這提示綿羊肺炎支原體p208編碼蛋白也可能是一個(gè)良好的免疫原且可能參與黏附過程。為了研究該蛋白的功能，本研究通過對(duì)編碼綿羊肺炎支原體P208蛋白的部分基因片段進(jìn)行了克隆，并成功在大腸桿菌中以可溶性蛋白的形式得到大量表達(dá)。利用山羊抗綿羊肺炎支原體全菌抗體進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果表明純化后的重組蛋白能與山羊抗綿羊肺炎支原體全菌抗體特異性結(jié)合，說明P208蛋白具有免疫原性，是綿羊肺炎支原體良好的免疫原之一。這同時(shí)也說明本研究所表達(dá)的重組蛋白可以作為抗原，在亞單位疫苗開發(fā)以及ELISA等綿羊肺炎支原體血清抗體檢測(cè)試劑盒的研制方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但是P208蛋白是否參與綿羊肺炎支原體的黏附過程尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

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