整體優(yōu)化的信號(hào)肽和人溶菌酶基因在畢赤酵母的高效表達(dá)

陳珊珊， 丁 健， 李 鑫， 劉 軍， 賈祿強(qiáng)， 槐強(qiáng)強(qiáng)， 孫佼文， 史仲平

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院/工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214100; 2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430040)

細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥性的增強(qiáng)使得越來(lái)越多的研究人員致力于開(kāi)發(fā)一種新型的抗菌化合物。溶菌酶的抗菌機(jī)制不同于抗生素，不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，已引起科學(xué)界的極大關(guān)注[1]。溶菌酶又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁中β-1,4糖苷鍵[2]，破壞細(xì)胞壁肽聚糖的結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)宿主細(xì)胞免受細(xì)菌感染。按來(lái)源可將溶菌酶分為微生物溶菌酶、植物溶菌酶和動(dòng)物溶菌酶，其中動(dòng)物溶菌酶又可分為c、g、i 3種類(lèi)型。人溶菌酶屬于c型，由130個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為14 700[3]，其表達(dá)量及活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他物種。

溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì)，能在胃腸內(nèi)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消化和吸收，對(duì)人及動(dòng)物無(wú)毒害作用，也不會(huì)在體內(nèi)殘留，是一種安全性很高的藥品、飼料和食品添加劑。在畜牧業(yè)溶菌酶可用作飼料防腐劑和殺菌劑，邱偉海等[4]報(bào)道飼料中添加溶菌酶抑制劑可有效控制豬仔因消化不良而引起的腹瀉；Sotirov等[5]報(bào)道溶菌酶可有效防治球蟲(chóng)病，提高雞體的健康，減少死亡；此外在飼料中添加溶菌酶、聚合磷酸鹽及甘氨酸等復(fù)合物可起到抑菌防腐的作用，延長(zhǎng)飼料的保質(zhì)期[6]。在醫(yī)學(xué)上溶菌酶具有抗菌、抗炎癥、抗HIV病毒以及抗腫瘤活性等應(yīng)用價(jià)值[7-10]。在食品行業(yè)，溶菌酶可作為抗菌防腐劑添加到食品中，且對(duì)人體無(wú)任何毒副作用[11]，也可利用其具有一定甜味的特點(diǎn)，作為低卡路里的食品甜味劑[12-13]。

目前，市場(chǎng)上銷(xiāo)售的溶菌酶主要是從雞蛋清、動(dòng)物臟器等中提取獲得的，這種溶菌酶熱穩(wěn)定性差，活力只有人溶菌酶活力的一半[14]。但人源溶菌酶受限于原料來(lái)源、純化精制成本等因素，制備量較少，無(wú)法滿足各領(lǐng)域的需求。因此，科研人員采用基因工程手段，將人源溶菌酶基因克隆至原核或真核表達(dá)載體中，用以生產(chǎn)溶菌酶。表達(dá)載體包括大腸桿菌[15]、釀酒酵母[16-17]、畢赤酵母[11, 18]以及黑曲霉[19]等。其中，巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)具有遺傳操作簡(jiǎn)單，擁有強(qiáng)誘導(dǎo)型甲醇氧化酶(AOX)啟動(dòng)子，能對(duì)外源蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾(包括糖基化和二硫鍵形成)等，表達(dá)的外源蛋白可通過(guò)信號(hào)肽引導(dǎo)分泌至胞外等諸多優(yōu)點(diǎn)，是表達(dá)真核細(xì)胞來(lái)源蛋白質(zhì)的理想系統(tǒng)之一。在將外源基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母前，研究者會(huì)根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。劉真英等[20]對(duì)柞蠶溶菌酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，其在畢赤酵母中表達(dá)量可達(dá)2.4 g/L，且純化后的柞蠶溶菌酶比酶活力達(dá)到23 970 U/mg。Zhou等[18]對(duì)人源溶菌酶基因進(jìn)行優(yōu)化，并轉(zhuǎn)入畢赤酵母(P.pastorisSMD1168)進(jìn)行表達(dá)，發(fā)酵上清液中人源溶菌酶蛋白濃度為331 mg/L，比酶活力達(dá)到7 069 U/mg。經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化，許多蛋白質(zhì)在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。但包括人源溶菌酶在內(nèi)，不少蛋白質(zhì)的基因編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后仍表達(dá)量較低。信號(hào)肽是蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的一個(gè)重要影響因素。有研究者發(fā)現(xiàn)，表達(dá)載體上的α信號(hào)肽序列優(yōu)化后，畢赤酵母中外源蛋白分泌表達(dá)量顯著提高[21-23]。因此，本研究根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性，對(duì)α信號(hào)肽序列和人源溶菌酶基因序列進(jìn)行整體優(yōu)化。并在優(yōu)化的信號(hào)肽序列上2處不同位置，增加39個(gè)堿基，獲得增長(zhǎng)的α信號(hào)肽序列，并與人源溶菌酶基因堿基序列相連。將2個(gè)優(yōu)化后的信號(hào)肽+溶菌酶基因堿基序列分別插入表達(dá)載體pPICZα，并轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71進(jìn)行表達(dá)，以期在不影響酶活力的前提下，提高人源溶菌酶在畢赤酵母中的表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和載體 真核表達(dá)載體pPICZαA購(gòu)自Invitrogen公司，大腸桿菌DH5α、畢赤酵母KM71為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶及試劑 DNA限制性內(nèi)切酶、DNA marker (DL2 000及DL10 000)、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、TaKaRaExTaq酶以及Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR購(gòu)自大連TaKaRa公司，zeocin、質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物回收及膠回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物公司，YNB、溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 通用引物 AOX-F：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；AOX-R：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′；MF4-F：5′-AGCTTTCGAAACGATGGCTATTCCA-3′；MF4-R：5′-AGCTTCTAGATTACACACCACATCC-3′。

1.1.4 培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基(DLB+LB)、酵母培養(yǎng)基(YPD、YPDS+zeocin)、誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基(BMGY、BMMY)配制及培養(yǎng)方法參照EasySelect； 5 L發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)基、甘油流加培養(yǎng)基、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[24]。

1.2 人源溶菌酶基因的設(shè)計(jì)合成及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)性，對(duì)調(diào)控表達(dá)產(chǎn)物分泌的信號(hào)肽序列及溶菌酶基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，并在這段序列5′端加上BspT104Ⅰ酶切位點(diǎn)，3′端加上XbaⅠ酶切位點(diǎn)。采用全基因人工合成，并克隆至pPICZαA載體中構(gòu)建含有人源溶菌酶基因的重組表達(dá)載體pPICZ-OptαF+hlyz。同時(shí)在已優(yōu)化的信號(hào)肽的2處不同位置，插入A I P 和E EA E A E A E P K等氨基酸，并完成增長(zhǎng)后信號(hào)肽序列的合成。將增長(zhǎng)的序列插入pPICZαA空載，構(gòu)建得到另一個(gè)人源溶菌酶表達(dá)載體pPICZ-EhnαF+hlyz(圖1)。

圖1 pPICZα-hlyz構(gòu)建示意圖Fig.1 The schematic diagram of pPICZα-hlyz structure

1.3 重組表達(dá)載體對(duì)畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及鑒定

經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的pPICZ-OptαF+hlyz及pPICZ-EhnαF+hlyz重組質(zhì)粒，用SacⅠ酶線性化并回收，DNA量為5～10 μg。采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71。取100 μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含Zeocin抗性的YPDS平板，培養(yǎng)2～3 d，觀察菌的生長(zhǎng)情況，將菌落用無(wú)菌水洗脫下來(lái)再經(jīng)Zeocin濃度為 200～1 000 μg/ml的YPD平板篩選，從而獲得更高拷貝數(shù)的菌株。

挑取平板上長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落于4 ml YPD液體試管，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)18～24 h，取100 μl菌懸液離心去上清液，加入50 μl裂解液并用槍頭吹打混勻，85 ℃熱變性15 min后，6 000 r/min離心2 min，取1 μl裂解的上清液作為PCR反應(yīng)模板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠DNA電泳驗(yàn)證。

1.4 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)

搖瓶表達(dá)：挑取單菌落接入裝有25 ml BMGY培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，放置于搖床中以200 r/min的轉(zhuǎn)速在30 ℃下培養(yǎng)18～20 h。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，5 000 r/min室溫離心5 min，除去上清液，用25 ml的BMMY培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h向培養(yǎng)基中添加無(wú)水甲醇，使其終濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)72 h后，離心取上清液作進(jìn)一步檢測(cè)分析。

5 L發(fā)酵罐表達(dá)：按13%的接種量將種子液接入發(fā)酵罐中，初始發(fā)酵裝液量為2 L，溫度30 ℃，通氣量為1.3 vvm，pH為6.0(用50%的磷酸和氨水調(diào)節(jié)pH)。發(fā)酵過(guò)程中溶解氧濃度(DO)逐漸下降，逐級(jí)提高攪拌速度將DO水平維持于20%以上。當(dāng)初始培養(yǎng)基中的甘油耗盡時(shí)，DO急劇上升，啟動(dòng)DO-Start甘油流加程序，進(jìn)入甘油流加階段。當(dāng)菌體濃度達(dá)到預(yù)期水平(OD600=200)時(shí)停止流加甘油，饑餓培養(yǎng)2 h后進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段。通過(guò)On-Off控制模式調(diào)節(jié)甲醇流加速度，將甲醇濃度控制在5～10 g/L[25]。對(duì)于產(chǎn)量較高的K4進(jìn)一步采取高密度(OD600=400)誘導(dǎo)策略。

1.5 重組人源溶菌酶蛋白產(chǎn)量分析及活力檢測(cè)

采用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)重組人源溶菌酶進(jìn)行定性分析，配制12%的分離膠及5%濃縮膠，電泳電壓120 V，考馬斯亮藍(lán)染色液染色10 min，脫色10 min。

對(duì)發(fā)酵液總蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法[26]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵上清液總蛋白質(zhì)含量。

利用管蝶法[27]鑒定人源溶菌酶的生物活性，并通過(guò)比濁法[28]定量測(cè)定人源溶菌酶酶活力大小。管碟法是效仿抗物素的生物學(xué)鑒定方法，指示菌為1.5%溶壁微球菌(OD600=1)，雙蝶制備好后靜置10 min，在牛津杯中加入樣品及陰性對(duì)照，24 h后觀察透明圈的大小。比濁法以溶壁微球菌作為底物，通過(guò)菌懸液OD450處吸光度值的變化進(jìn)行酶活力測(cè)定。溶壁微球菌活化及培養(yǎng)步驟參照國(guó)標(biāo)GB/T 30990-2014。稱(chēng)取一定量的溶菌酶標(biāo)品(100 000 U/mg)，用緩沖液稀釋成一定的濃度梯度(50～250 U/ml)，取0.5 ml的酶液加入2.5 ml的菌懸液混勻，記錄在450 nm處反應(yīng)1 min時(shí)的讀數(shù)A1，反應(yīng)2 min時(shí)的讀數(shù)A2，計(jì)算△E=|A1-A2|的值，以酶活力為縱坐標(biāo)，△E為橫坐標(biāo)作酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣測(cè)定發(fā)酵上清液的△E(1 min內(nèi)的變化范圍在 0.025～0.125)，根據(jù)酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵上清液的酶活力。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel2010、Origin8.5處理，使用SPSS10.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號(hào)肽和溶菌酶基因堿基序列的整體優(yōu)化

原始序列存在的主要問(wèn)題有：1.載體上的釀酒酵母α信號(hào)肽及人源溶菌酶基因編碼序列所使用的密碼子有不少在畢赤酵母中屬于稀有密碼子；2.序列GC含量不平衡；3.序列中存在較多重復(fù)序列。針對(duì)上述問(wèn)題，我們將α信號(hào)肽及人源溶菌酶序列作為一個(gè)整體進(jìn)行序列優(yōu)化，優(yōu)化策略如下：1. 使用畢赤酵母偏愛(ài)密碼子，替換序列中的稀有密碼子；2.對(duì)α信號(hào)肽和人源溶菌酶蛋白中出現(xiàn)的豐度氨基酸，除了選擇偏愛(ài)密碼子外，也使用畢赤酵母第二或第三常用密碼子，避免在表達(dá)過(guò)程中出現(xiàn)某一tRNA不足，影響蛋白質(zhì)表達(dá)量；3.平衡序列整體及局部區(qū)域的GC含量控制在40%～60%；4.避免出現(xiàn)影響mRNA穩(wěn)定及其他不利于表達(dá)的序列。按上述策略優(yōu)化后的序列如圖2所示。其中，α信號(hào)肽在原始序列密碼子優(yōu)化的基礎(chǔ)上，在序列ATG后增加了共9個(gè)堿基，對(duì)應(yīng)的氨基酸為AIP，在序列的190 bp位置后面加上1個(gè)胞嘧啶(C)，而在193 bp后面加上29個(gè)堿基，連同193位的堿基一起表達(dá)10個(gè)氨基酸(氨基酸序列為E E A E A E A E P K)。因此，增長(zhǎng)后的α信號(hào)肽比僅做密碼子優(yōu)化的信號(hào)肽多表達(dá)13個(gè)氨基酸。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)性和密碼子組成的分析，對(duì)負(fù)責(zé)分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列和溶菌酶基因進(jìn)行整體優(yōu)化，并完成全序列合成。通過(guò)BspT104Ⅰ和XbaⅠ酶切后，將合成序列插入pPICZαA載體中，構(gòu)建得到人源溶菌酶表達(dá)載體pPICZ-OptαF+hlyz。使用引物5′AOX-F/3′AOX-R 對(duì)載體進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出912 bp片段與信號(hào)肽加溶菌酶基因的大小完全一致。

以相同的方法，將增長(zhǎng)的信號(hào)肽和溶菌酶基因堿基序列插入pPICZα載體中，構(gòu)建得到另一個(gè)人源溶菌酶表達(dá)載體pPICZ-EhnαF+hlyz。使用引物MF4-F/MF4-R對(duì)載體進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出722 bp片段與增長(zhǎng)的信號(hào)肽序列的大小完全一致。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，上述PCR產(chǎn)物序列與對(duì)應(yīng)的原始合成序列完全一致。

Q(Quary)：信號(hào)肽序列和人源溶菌酶基因堿基序列作為一個(gè)整體進(jìn)行密碼子優(yōu)化；S(Sbjct)：在整體優(yōu)化基礎(chǔ)上作增長(zhǎng)信號(hào)肽優(yōu)化處理。信號(hào)肽：267 bp (增長(zhǎng)后306 bp)；溶菌酶基因：393 bp。方框中字母為2處增長(zhǎng)序列插入位置。圖2 原始的α信號(hào)肽和溶菌酶基因序列與優(yōu)化后序列的比對(duì)Fig.2 Comparison of the original α-factor signal and human lysozyme(hLYZ) sequence with the optimized sequence

2.3 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及篩選

將電轉(zhuǎn)化后的酵母均勻涂布在Zeocin濃度為100 μg/ml的YPDS平板上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，將平板上的單菌落洗脫下來(lái)，按照方法1.3所述方法逐步增加抗生素濃度，提高篩選壓力，篩選出可能帶有高拷貝目的基因的菌株。整體優(yōu)化的α信號(hào)肽和人源溶菌酶基因堿基序列重組進(jìn)入畢赤酵母，經(jīng)抗生素篩選后獲得的重組子命名為K1，而將整體優(yōu)化的α信號(hào)肽和人源溶菌酶基因又整合了增長(zhǎng)信號(hào)肽的序列重組到畢赤酵母基因組上，經(jīng)抗生素篩選后獲得的重組子命名為K4。以AOX-F/AOX-R為引物對(duì)K1基因組，以MF4-F/MF4-R為引物對(duì)K4基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，與預(yù)期基因大小相符。DNA測(cè)序結(jié)果表明2條整體優(yōu)化后的信號(hào)肽和溶菌酶基因已穩(wěn)定整合到畢赤酵母基因組上。

a圖:M：DL10 000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：陰性對(duì)照；2～3：K1重組子PCR鑒定。b圖:M：DL10 000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：K4重組子PCR鑒定。圖3 畢赤酵母重組子PCR鑒定Fig.3 Identification of Pichia pastoris recombinants by PCR

2.4 重組菌株搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)

對(duì)上述篩選并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的重組子進(jìn)行搖瓶表達(dá)。在誘導(dǎo)表達(dá)72 h后取發(fā)酵上清液，用SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4所示。1～3泳道表示重組子K1(信號(hào)肽和溶菌酶基因整體優(yōu)化的重組子)搖瓶誘導(dǎo)試驗(yàn)的3個(gè)重復(fù)，在14 700處有明顯的條帶。5～7泳道表示重組子K4(信號(hào)肽和溶解酶基因整體優(yōu)化后又整合了增長(zhǎng)信號(hào)肽的重組子)搖瓶誘導(dǎo)試驗(yàn)的3個(gè)重復(fù)，K4重組子在14 700處的條帶亮度明顯高于重組子K1。通過(guò)Bradford法測(cè)定發(fā)酵上清液中總蛋白質(zhì)含量，結(jié)果列于表1。信號(hào)肽和溶菌酶基因整體優(yōu)化的重組子K1，平均總蛋白質(zhì)產(chǎn)量為260 mg/L；整體優(yōu)化的信號(hào)肽和溶菌酶基因又整合了增長(zhǎng)信號(hào)肽的重組子K4，平均總蛋白質(zhì)產(chǎn)量為320 mg/L，相比重組子K1提高了23%。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～3：K1重組子誘導(dǎo)表達(dá)72 h后發(fā)酵上清液；5～7：K4重組子誘導(dǎo)表達(dá)72 h后發(fā)酵上清液。圖4 搖瓶表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression product by shaking bottle

2.5 人源溶菌酶酶活力

采用管碟法對(duì)重組子所表達(dá)蛋白質(zhì)的抑菌活力進(jìn)行定性檢測(cè)，以磷酸鹽緩沖液作空白對(duì)照，以KM71原始菌和攜帶pPICZα空載體的KM71菌株經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的上清液作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖5所示，空白對(duì)照、KM71原始菌和攜帶pPICZα空載體的KM71誘導(dǎo)的發(fā)酵上清液都未見(jiàn)有透明圈出現(xiàn)，而重組子K1和K4的發(fā)酵上清液所在區(qū)域，有明顯透明圈出現(xiàn)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，重組子K4形成的透明圈要大于K1形成的透明圈。

K1：信號(hào)肽和溶菌酶基因整體優(yōu)化的重組子誘導(dǎo)表達(dá)的上清液；K4：整體優(yōu)化的信號(hào)肽和溶菌酶基因又整合了增長(zhǎng)信號(hào)肽的重組子誘導(dǎo)表達(dá)的上清液；1：空白對(duì)照；2：攜帶pPICZα空載體的酵母重組子誘導(dǎo)表達(dá)的上清液；3：KM71原始菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液。圖5 重組畢赤酵母表達(dá)的人源溶菌酶抑菌效果Fig.5 Measurment of hLYZ activity by cylinder-plate method

進(jìn)一步利用國(guó)標(biāo)GB/T 30990-2014，以雞蛋白溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示)，對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)的人源溶菌酶進(jìn)行活力檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。信號(hào)肽和溶菌酶整體優(yōu)化的重組子K1，總酶活力平均值為12 937.0 U/ml；整體優(yōu)化的信號(hào)肽和溶菌酶基因又整合了增長(zhǎng)信號(hào)肽的重組子K4，總酶活力平均值為16 973.5 U/ml，略高于重組子K1的總酶活力。

圖6 以雞蛋白溶菌酶為標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Enzyme activity standard curve by chicken egg white lysozyme

表1重組子K1、K4搖瓶蛋白質(zhì)表達(dá)量及酶活力

Table1TotalproteinandenzymeactivityresultofK1andK4byshakingbottle

重組子平均總蛋白(mg/L)平均總酶活力(U/ml)K1260±6B12937.0±1255.8BK4320±10A16973.5±627.9A

K1：信號(hào)肽和溶菌酶基因整體優(yōu)化的重組子；K4：信號(hào)肽和溶菌酶基因整體優(yōu)化又整合了增長(zhǎng)信號(hào)肽的重組子。同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.6 重組菌株發(fā)酵罐規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)

在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行重組子K1和K4的誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，由于K4搖瓶蛋白質(zhì)表達(dá)量及酶活力都比較高，因此K1采取低密度誘導(dǎo)策略，K4采取高低2種誘導(dǎo)策略。分別采集3個(gè)發(fā)酵批次誘導(dǎo)期的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖7所示。1～3泳道分別表示K1低密度(菌體濃度OD600=200)、K4低密度(菌體濃度OD600=200)、K4高密度(菌體濃度OD600=400)的發(fā)酵上清液樣品。采用Bradford法測(cè)定發(fā)酵上清液中的總蛋白質(zhì)濃度，總蛋白質(zhì)濃度隨時(shí)間呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)(圖8a)。K1菌株發(fā)酵批次誘導(dǎo)80 h總蛋白質(zhì)濃度為1.71 g/L；K4低密度發(fā)酵批次誘導(dǎo)80 h總蛋白質(zhì)濃度為2.54 g/L。K4高密度發(fā)酵批次誘導(dǎo)54 h總蛋白質(zhì)濃度為3.02 g/L。3個(gè)批次發(fā)酵上清液中人源溶菌酶蛋白占總蛋白質(zhì)的比例均不低于85%。采用比濁法測(cè)定3個(gè)批次最終發(fā)酵上清液的溶菌酶活力，結(jié)果表明：K1、K4低密度誘導(dǎo)80 h以及K4高密度誘導(dǎo)54 h發(fā)酵液中的總酶活力分別為262 152.0 U/ml、258 712.0 U/ml、324 072.0 U/ml(圖8b)，對(duì)應(yīng)的比酶活力分別為152 971.9 U/mg、101 996.4 U/mg、107 030.7 U/mg(圖8b)。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：K1重組子低密度誘導(dǎo)80 h發(fā)酵上清液；2：K4重組子低密度誘導(dǎo)80 h發(fā)酵上清液；3：K4重組子高密度誘導(dǎo)54 h發(fā)酵上清液。圖7 重組菌株發(fā)酵罐表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of the expression product via fermentation

a： 3個(gè)發(fā)酵批次總蛋白濃度隨時(shí)間變化趨勢(shì)；b：3個(gè)發(fā)酵批次最終總酶活力及比酶活力。K1(低)、K4(低)：K1、K4重組子低密度(OD600=200)甲醇誘導(dǎo)；K4(高)：K4重組子高密度(OD600=400)甲醇誘導(dǎo)。不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖8 不同批次最終總蛋白及酶活力Fig.8 Total protein and enzyme activities at different fermentation batches

3 討 論

目前，已有500多種外源蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)成功表達(dá)，但絕大多數(shù)外源蛋白的表達(dá)量并不是很高。人源溶菌酶在醫(yī)藥、食品、畜牧等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景，雖然通過(guò)基因工程的手段解決了原料來(lái)源、純化成本等限制因素，但其在外源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量和單位體積發(fā)酵液中酶活總量并不高。因此，提高人源溶菌酶的表達(dá)量及酶活力是將其向市場(chǎng)推廣的根本途徑。許多研究人員根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性，對(duì)溶菌酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使溶菌酶蛋白表達(dá)量和酶活力總量得到一定程度提高[18,20,29]。但影響畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的因素有很多，存在于轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊修飾、細(xì)胞分泌等各個(gè)環(huán)節(jié)，因此，僅通過(guò)優(yōu)化外源基因序列密碼子對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響程度非常有限。信號(hào)肽是分泌型蛋白質(zhì)N端的一段富含疏水性氨基酸殘基的短肽，其殘基性質(zhì)對(duì)于蛋白質(zhì)的分泌效率和后續(xù)信號(hào)肽切割具有重要影響。陳熙等[22]利用PCR法將人源溶菌酶成熟肽與載體信號(hào)肽連接處的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)果表明突變體人源溶菌酶表達(dá)量和活力較突變前均有顯著提高。Xiong等[30]在優(yōu)化植酸酶基因序列密碼子的同時(shí)，使用經(jīng)密碼子優(yōu)化的釀酒酵母α信號(hào)肽序列替換原有信號(hào)肽，整體轉(zhuǎn)入畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，相比使用原始信號(hào)肽的菌株，植酸酶產(chǎn)量提高了14.5倍。

本研究將α信號(hào)肽和溶菌酶基因作為整體進(jìn)行密碼子優(yōu)化，再轉(zhuǎn)入畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果顯示，5 L發(fā)酵罐誘導(dǎo)培養(yǎng)80 h后，總蛋白質(zhì)表達(dá)量為1.71 g/L(人源溶菌酶占比超過(guò)85%)，單位發(fā)酵液的總酶活力達(dá)到262 152.0 U/ml。相比之下，前期僅針對(duì)人源溶菌酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化的報(bào)道中，幾乎沒(méi)有見(jiàn)到總蛋白表達(dá)量到克級(jí)、單位發(fā)酵液總酶活力達(dá)到100 000.0 U/ml以上的。上述結(jié)果表明，將α信號(hào)肽和外源基因作為整體進(jìn)行基因序列的密碼子優(yōu)化，可顯著提高外源蛋白的分泌表達(dá)量。在α信號(hào)肽和溶菌酶基因堿基序列整體優(yōu)化的基礎(chǔ)上，我們又針對(duì)α信號(hào)肽序列做進(jìn)一步優(yōu)化，在α信號(hào)肽起始密碼子ATG后增加畢赤酵母Aox1基因ATG后編碼3個(gè)氨基酸(AIP)的堿基，另外，在信號(hào)肽序列第64位氨基酸后面，插入10個(gè)氨基酸(氨基酸序列為E E A E A E A E P K)。上述2種信號(hào)肽的改造曾應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)植酸酶和胰島素，外源蛋白分泌表達(dá)量分別提高5倍[21]和2[31]倍多。5 L發(fā)酵罐誘導(dǎo)培養(yǎng)80 h后，攜帶增長(zhǎng)型α信號(hào)肽和溶菌酶基因的畢赤酵母重組子K4表達(dá)蛋白總量達(dá)到2.54 g/L，相比未增長(zhǎng)信號(hào)肽前的重組子K1提高了48.5%。但其單位發(fā)酵液的總酶活力僅為258 712.0 U/ml，相比增長(zhǎng)信號(hào)肽前的水平還略有降低。這可能是由于增長(zhǎng)α信號(hào)肽的引入使畢赤酵母蛋白質(zhì)分泌效率大幅提高，而畢赤酵母自身蛋白質(zhì)折疊和修飾的能力有限，無(wú)法將大量分泌表達(dá)的溶菌酶酶原激活成為有活性的酶，造成了比酶活力的下降。為驗(yàn)證這一推論，在5 L發(fā)酵罐下采用了高密度誘導(dǎo)策略。誘導(dǎo)54 h后重組子K4的總蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到3.2 g/L，單位發(fā)酵液的總酶活力為324 072.0 U/ml，對(duì)應(yīng)的比酶活力與低密度誘導(dǎo)條件下獲得的比酶活力水平相當(dāng)。該結(jié)果基本佐證了上述推論。

本研究通過(guò)整體優(yōu)化α信號(hào)肽和人源溶菌酶基因，實(shí)現(xiàn)了人源溶菌酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)。在α信號(hào)肽和人源溶菌酶基因整體優(yōu)化后又整合增長(zhǎng)α信號(hào)肽后，人源溶菌酶在畢赤酵母中的表達(dá)量進(jìn)一步提高，但受限于酵母自身蛋白質(zhì)折疊修飾的能力范圍，人源溶菌酶的比酶活力有所下降。在后續(xù)研究中我們將著眼于提高畢赤酵母的蛋白質(zhì)折疊和修飾效率，以期在畢赤酵母高表達(dá)人源溶菌酶的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)更高的比酶活力。

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