長鏈非編碼RNA CasC7對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

嚴(yán)德文，胡盈盈，梁宗文，項(xiàng)軍淼，余丹揚(yáng)，段萍

（1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 婦科，浙江 臺(tái)州 318020；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江溫州 325027）

宮頸癌是第三大最常見的婦科腫瘤，同時(shí)也是全世界婦女癌癥相關(guān)死亡的第四大原因；全球的宮頸癌發(fā)病率每年約為530 000例，每年近275 000人死亡；且發(fā)病年齡愈加趨于年輕化?？墒?，對(duì)于宮頸癌發(fā)生發(fā)展中涉及的分子機(jī)制仍然知之甚少。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）被定義為長度大于200個(gè)核苷酸，具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)功能但不編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本[1-2]。lncRNA能通過參與表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控這三個(gè)層面影響細(xì)胞的胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)編碼基因調(diào)控、細(xì)胞增殖凋亡、腫瘤細(xì)胞的放化療耐性等生理病理過程[2-3]。而且越來越多的研究證實(shí)lncRNA涉及到眾多不同類型的腫瘤，如肝癌、胃癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌等的增殖、轉(zhuǎn)移侵襲等生物學(xué)過程[4-8]。其中，CasC7是RISC催化組件（AGO2）基因中一條9 346 bp的lncRNA，其在腫瘤中的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究旨在探究lncRNA CasC7在宮頸癌中的表達(dá)及其促增殖作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞（HPV18陽性）、SiHa細(xì)胞（HPV16陽性）、CaSki細(xì)胞（HPV16陽性）及H8細(xì)胞（正常宮頸上皮細(xì)胞）均購自中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心。

1.1.2 標(biāo)本：選取2014年6月至2016年6月于臺(tái)州市第一人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的患者，其中40例宮頸癌組織收集自未經(jīng)過放療或化療的廣泛性子宮切除手術(shù)的宮頸癌患者，＞ IIa的標(biāo)本取自放化療前行陰道鏡檢查的患者。40例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織取自行宮頸環(huán)形電切術(shù)的患者并且根據(jù)組織病理學(xué)診斷分為CIN I 14例，CIN II 13例，CIN III 13例。40例宮頸正常組織取自經(jīng)子宮全切手術(shù)的子宮肌瘤或子宮腺肌瘤患者，且均經(jīng)病理確認(rèn)為無腫瘤組織且人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）及薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（thin-cytologic test，TCT）均為陰性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.1.3 主要試劑：胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit購自日本TOYOBO公司；SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑購自美國羅氏公司；CCK-8試劑購自日本同仁株式會(huì)社；其余試劑為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)：使用生物信息學(xué)方法挖掘公共芯片數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中的RNA表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)。從GSE9750表達(dá)譜芯片中提取到9例宮頸癌細(xì)胞系，33例宮頸癌組織以及24例宮頸組織的lncRNA CasC7相關(guān)表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成：①細(xì)胞RNA提取：將細(xì)胞密度達(dá)80%～100%的宮頸癌細(xì)胞用PBS清洗3次后，TRIrol試劑裂解細(xì)胞，異丙醇沉淀總RNA，75%乙醇洗滌RNA后用DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。②組織RNA提?。呵腥∫恍K-80 ℃保存的宮頸癌樣本組織，研磨震蕩后，用TRIzol溶解總RNA，異丙醇沉淀總RNA，75%乙醇洗滌RNA后用DEPC水溶解RNA。在紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。③cDNA合成：取1 μg的總RNA為模板，以O(shè)ligo（dT）引物和隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應(yīng)條件：16 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，4 ℃永久。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：取上述反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 1 μL，加入10 μL 2×SYBR Green Premix配制成20 μL的反應(yīng)體系。置于Step One PlusTMqRT-PCR系統(tǒng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 32 s、72 ℃ 32 s循環(huán)40次。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，且以GAPDH作為內(nèi)參，以2-△△CT方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。CasC7上游引物為5’-TGTTTGATTCCTCGTCGCT-3’，下游引物為5’-GGCACCGTAATGGCACTG-3’；GAPDH上游引物為5’-CTGCCAACGTGTCAGTGGTG-3’，下游引物為5’-TC AGTGTAGCCCAGGATGCC-3’。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作步驟如下（以96孔板轉(zhuǎn)染為例）：轉(zhuǎn)染前1 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，每孔接種約5 000個(gè)細(xì)胞。過夜后在無菌EP管中加入25 μL Opti-MEM轉(zhuǎn)染試劑，分別加入0.25 μL的siRNA或者0.25 μL的Lipofectamine 2000，輕柔混合后，室溫靜置5 min；將含有Lipofectamine 2000的Opti-MEM試劑加入到含siRNA的Opti-MEM轉(zhuǎn)染試劑中，混合后室溫靜置15～25 min，以形成siRNA/lipo-fectamine復(fù)合物；取siRNA/lipofectamine復(fù)合物50 μL加入到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來回輕柔晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4～6 h后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基，以防止細(xì)胞死亡，繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)用。

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)lncRNA CasC7的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。對(duì)SiHa、CaSki、HeLa和H8細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別將細(xì)胞接種至96孔板中，過夜后分別進(jìn)行si-CasC7、si-NC的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染完成后根據(jù)不同時(shí)相點(diǎn)（0、24、48、72 h）進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。每孔加入10 μL CCK-8溶液，再置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育約1 h后置于酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，2組間比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CasC7在表達(dá)譜芯片中的表達(dá)情況 通過GEO數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的芯片數(shù)據(jù)查找lncRNA CasC7的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，GSE9750表達(dá)譜芯片中9種宮頸癌細(xì)胞系和33例宮頸癌組織的lncRNA CasC7表達(dá)量均較正常宮頸組織升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 CasC7在宮頸癌表達(dá)譜芯片GSE9750中的表達(dá)情況

2.2 CasC7在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá) qRTPCR結(jié)果顯示，宮頸癌組織中的lncRNA CasC7表達(dá)水平明顯高于CIN組織（P＜0.01）及宮頸正常組織（P＜0.001），CIN組織中CasC7的表達(dá)水平高于宮頸正常組織（P＜0.01），見圖2A。以正常宮頸上皮細(xì)胞（H8細(xì)胞）為參照，在3種宮頸癌細(xì)胞系中CasC7均顯著高表達(dá)（P＜0.05），見圖2B。

2.3 CasC7表達(dá)情況與宮頸癌的臨床病理特征的關(guān)系 為了分析宮頸癌中l(wèi)ncRNA CasC7的表達(dá)水平和患者臨床病理之間的關(guān)系，將40例宮頸癌患者根據(jù)其臨床特征及病理嚴(yán)重程度分為2組，比較2組間CasC7表達(dá)水平的差異。CasC7表達(dá)水平越高，其相應(yīng)的宮頸癌腫瘤組織標(biāo)本的FIGO分期越高（P=0.001），分化越差（P=0.015），但與其他臨床病理特征如年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率、血清鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）的水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)CasC7在宮頸癌中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 CasC7對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法觀察下調(diào)lncRNA CasC7對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染si-NC的對(duì)照組比，轉(zhuǎn)染了siRNA CasC7的3種宮頸癌細(xì)胞（SiHa、CaSki、HeLa）的細(xì)胞增殖能力均有所下降（P＜0.05）。并且，siRNA CasC7對(duì)宮頸癌細(xì)胞系生長的抑制效應(yīng)呈時(shí)間依賴性（見圖3）。

3 討論

人類基因組中，能編碼蛋白質(zhì)的基因有2～2.5萬個(gè)，只占整個(gè)基因組的不到2%，大部分基因轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA（noncoding RNAs，ncRNAs）[4-5]。這些序列過去被認(rèn)為是基因組中的“噪音”或者“暗物質(zhì)”。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明這些“噪音”能發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，這些基因序列絕大多數(shù)能以組織特異性或時(shí)空特異性的方式轉(zhuǎn)錄成RNA，其中包括lncRNA[6-7]。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)堿基的ncRNA，且無或很少有編碼蛋白的能力[9]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達(dá)或功能異常與癌癥、退行性神經(jīng)疾病等人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)[10-14]。其中，lncRNA就被報(bào)道與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；如lncRNA MEG3在宮頸癌中下調(diào)表達(dá)并通過調(diào)節(jié)miR-21而影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡[15]；下調(diào)宮頸癌中MALAT1的表達(dá)能通過影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程從而抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16]；lncRNA HOTAIR通過調(diào)節(jié)mTOR通路從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。同時(shí)研究表明lncRNA與宮頸癌的臨床病理學(xué)特征密切相關(guān)：如lncRNA-TCONS_00026907過表達(dá)的宮頸癌患者，其腫瘤更大，TNM分期更晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多[18]。而過表達(dá)lncRNA-ANRIL與宮頸癌患者的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，同時(shí)是宮頸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]。此外，lncRNA-HOXA11-AS過表達(dá)會(huì)促進(jìn)宮頸癌的脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時(shí)影響患者預(yù)后[20]。

表1 CasC7表達(dá)水平和宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n=40，M（P25，P75）]

圖3 轉(zhuǎn)染si-CasC7抑制宮頸癌細(xì)胞增殖

本研究率先報(bào)道lncRNA CasC7在宮頸癌中的作用。我們首先通過提取GSE9750表達(dá)譜芯片中RNA CasC7相關(guān)的表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示相較于24例正常的宮頸組織，lncRNA CasC7在33例宮頸癌組織以及9種宮頸癌細(xì)胞中均明顯高表達(dá)。芯片的9種宮頸癌細(xì)胞系包含C4-I、CaSki、C-33A、HT-3、SiHa、SW756、MS751、ME-180、HeLa細(xì)胞系，我們通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了lncRNA CasC7在SiHa、CaSki、HeLa這3種常見宮頸癌細(xì)胞系以及宮頸癌組織標(biāo)本中表達(dá)水平和芯片的表達(dá)情況一致。同時(shí)，我們分析lncRNA CasC7的表達(dá)水平和臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CasC7的高表達(dá)與更高的FIGO分期，更差的分化有關(guān)。LENNOX等[21]證實(shí)了lncRNA CasC7既存在于胞核中也存在于胞漿中，因此我們通過siRNA瞬時(shí)抑制CasC7表達(dá)的方法，證實(shí)下調(diào)CasC7的表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步從細(xì)胞學(xué)行為闡述了CasC7在宮頸癌中的促癌基因作用。

[1]XING Z, PARK P K, LIN C, et al. LncRNA BCAR4 wires up signaling transduction in breast cancer[J]. RNA Biol,2015, 12(7): 681-689.

[2]IGUCHI T, UCHI R, NAMBARA S, et al. A long noncoding RNA, lncRNA-ATB, is involved in the progression and prognosis of colorectal cancer[J]. Anticancer Res, 2015,35(3): 1385-1388.

[3]ZHUANG J, LU Q, SHEN B, et al. TGFβ1 secreted by cancer-associated fibroblasts induces epithelial-mesenchymal transition of bladder cancer cells through lncRNA-ZEB-2NAT[J]. Sci Rep, 2015, 5: 11924.

[4]ARASE M, HORIGUCHI K, EHATA S, et al. Transforming growth factor-β-induced lncRNA-Smad7 inhibits apoptosis of mouse breast cancer JygMC (A) cells[J]. Cancer Sci,2014, 105(8): 974-982.

[5]SCHMITT A M, CHANG H Y. Long noncoding RNAs in cancer pathways[J]. Cancer Cell, 2016, 29(4): 452-463.

[6]YLIP?? A, KIVINUMMI K, KOHVAKKA A, et al. Transcriptome sequencing reveals PCAT5 as a novel ERG-regulated long noncoding RNA in prostate cancer[J]. Cancer Res, 2015, 75(19): 4026-4031.

[7]WANG Y, HE L, DU Y, et al. The long noncoding RNA lncTCF7 promotes self-renewal of human liver cancer stem cells through activation of Wnt signaling[J]. Cell Stem Cell,2015, 16(4): 413-425.

[8]孫祥威, 胡盈盈, 徐劍峰, 等. 長鏈非編碼RNA AL049452在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 47(8)： 566-570.

[9]QIU M, XU Y, WANG J, et al. A novel lncRNA, LUADT1,promotes lung adenocarcinoma proliferation via the epigenetic suppression of p27[J]. Cell Death Dis, 2015, 6: e1858.

[10]ZHANG S, ZHANG G, LIU J. Long noncoding RNA PVT1 promotes cervical cancer progression through epigenetically silencing miR-200b[J]. APMIS, 2016, 124(8): 649-658.

[11]YACQUB-USMAN K, PICKARD M R, WILLIAMS G T.Reciprocal regulation of GAS5 lncRNA levels and mTOR inhibitor action in prostate cancer cells[J]. Prostate, 2015, 75(7): 693-705.

[12]GUTSCHNER T, H?MMERLE M, EISSMANN M, et al.The noncoding RNA MALAT1 is a critical regulator of the metastasis phenotype of lung cancer cells[J]. Cancer Res,2013, 73(3): 1180-1189.

[13]TAN J Y, VANCE K W, VARELA M A, et al. Cross-talking noncoding RNAs contribute to cell-speci fi c neurodegeneration in SCA7[J]. Nat Struct Mol Biol, 2014, 21(11): 955-961.

[14]TAJIRI N, ACOSTA S A, SHAHADUZZAMAN M, et al.Intravenous transplants of human adipose-derived stem cell protect the brain from traumatic brain injury-induced neurodegeneration and motor and cognitive impairments: cell graft biodistribution and soluble factors in young and aged rats[J]. J Neurosci, 2014, 34(1): 313-326.

[15]ZHANG J, YAO T, WANG Y, et al. Long noncoding RNA MEG3 is downregulated in cervical cancer and affects cell proliferation and apoptosis by regulating miR-21[J]. Cancer Biol Ther, 2016, 17(1): 104-113.

[16]SUN R, QIN C, JIANG B, et al. Down-regulation of MALAT1 inhibits cervical cancer cell invasion and metastasis by inhibition of epithelial-mesenchymal transition[J].Mol Biosyst, 2016, 12(3): 952-962.

[17]ZHANG D, ZHOU X H, ZHANG J, et al. Propofol promotes cell apoptosis via inhibiting HOTAIR mediated mTOR pathway in cervical cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 468(4): 561-567.

[18]JIN X, CHEN X, HU Y, et al. LncRNA-TCONS_00026907 is involved in the progression and prognosis of cervical cancer through inhibiting miR-143-5p[J]. Cancer Med, 2017, 6(6): 1409-1423.

[19]ZHANG D, SUN G, ZHANG H, et al. Long non-coding RNA ANRIL indicates a poor prognosis of cervical cancer and promotes carcinogenesis via PI3K/Akt pathways[J].Biomed Pharmacother, 2017, 85: 511-516.

[20]KIM H J, EOH K J, KIM L K, et al. The long noncoding RNA HOXA11 antisense induces tumor progression and stemness maintenance in cervical cancer[J]. Oncotarget,2016, 7(50): 83001-83016.

[21]LENNOX K A,BEHLKE M A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides[J].Nucleic Acids Res, 2016, 44(2): 863-877.