神經(jīng)肌肉電刺激對(duì)低O2高CO2大鼠下肢骨骼肌miR-1相關(guān)通路的影響

潘錄錄，支英豪，王小同

（1.溫州市中醫(yī)院 康復(fù)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)科，浙江 溫州325027）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一組氣流受限為特征，氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，但可預(yù)防和治療的疾病。許多研究均表明COPD患者存在不同程度的骨骼肌功能障礙，主要體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)耐量的下降[1-2]。其中COPD患者下肢骨骼肌具有特征性改變：能量代謝形式轉(zhuǎn)變，線粒體密度降低，活性氧自由基產(chǎn)生增多等，這些改變可以歸咎為慢肌纖維的減少（I型肌纖維向 II型轉(zhuǎn)變），最終導(dǎo)致肌耐力下降[3]。然而COPD骨骼肌功能障礙的確切病理生理機(jī)制仍不明確[4]。

本課題組前期以慢性間歇性低O2高CO2（chronic intermittent hypoxia hypercapnia，CIHH）動(dòng)物模型成功模擬了COPD的主要病理生理過(guò)程[5]，發(fā)現(xiàn)大鼠暴露在CIHH環(huán)境僅超過(guò)2周即可造成骨骼肌障礙，肌纖維出現(xiàn)局部萎縮，并且排列紊亂，脂肪沉積增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞明顯[6-7]。證實(shí)了COPD模型大鼠存在骨骼肌功能障礙。研究表明miR-1與骨骼肌障礙關(guān)系密切，miR-1可通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌相關(guān)的蛋白調(diào)節(jié)骨骼肌基因表達(dá)，進(jìn)而影響肌細(xì)胞的增生和分化過(guò)程[8]。組蛋白脫乙酰基酶4（histone deacetylase 4，HDAC4)、肌細(xì)胞促進(jìn)因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF-2）和過(guò)氧化體增殖物激活型受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferators ac-tivated receptor coactivator 1α，PGC-1α）均是miR-1可能影響的下游蛋白分子，因此通過(guò)測(cè)定miR-1及相關(guān)信號(hào)通路可進(jìn)一步明確骨骼肌障礙情況，探索其在骨骼肌中的作用。本研究通過(guò)測(cè)定miR-1及相關(guān)信號(hào)通路的蛋白變化，探討COPD大鼠模型骨骼肌功能障礙的可能機(jī)制，同時(shí)通過(guò)應(yīng)用神經(jīng)肌肉電刺激（neuromuscular electrical stimu-lation，NMES）進(jìn)一步研究康復(fù)訓(xùn)練對(duì)COPD骨骼肌功能障礙的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：成年SPF級(jí)雄性SD大鼠24只（由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：wydw2014-0006）。初始體質(zhì)量為160～180 g。將大鼠編號(hào)后按照隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組（NC組）、造模組（HH組）和電刺激組（HE組），每組8只。

1.1.2 儀器：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)復(fù)合模擬艙（濰坊華信氧業(yè)有限公司），電刺激儀（HANS-200E，濟(jì)南濟(jì)生生物醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 低O2高CO2模型建立[7]：將HH組和HE組大鼠放入氧艙內(nèi)飼養(yǎng)，飼料及水充足，選用低O2高CO2模式，維持艙內(nèi)O2濃度為9.0%～11.0%，CO2濃度為5.0%～6.0%，每天8 h，每周7 d，一共4周，造模時(shí)NC組大鼠置于對(duì)照艙內(nèi)。每天造模完成后3組大鼠放置在同一房間內(nèi)（室溫22 ℃左右，相對(duì)濕度45%～65%），各組均可自由獲取水和食物。

1.2.2 NMES方法：將所有大鼠固定好，雙側(cè)小腿腓腸肌肌腹部局部去毛，放置表面電極片（1.5 cm×1.5 cm）使之完全覆蓋肌肉，只有HE組大鼠應(yīng)用電刺激儀器進(jìn)行刺激。參數(shù)：100 Hz和2 Hz交替進(jìn)行的電刺激（持續(xù)時(shí)間均為3 s，脈沖持續(xù)時(shí)間：0.3～1.0 ms，根據(jù)頻率改變而改變）；強(qiáng)度以中等程度的肌肉收縮為準(zhǔn)（2～5 mA）。

1.2.3 耐力跑步能力測(cè)定：參照文獻(xiàn)[9]，造模完成后進(jìn)行動(dòng)物耐力跑步能力測(cè)定。第一階段（2 d）：逐漸增加大鼠跑步的時(shí)間使大鼠適應(yīng)跑臺(tái)（ZH-PT，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。使大鼠能在速度為10 m/min，傾斜度為15°的跑臺(tái)上跑步。接下來(lái)，緩慢地增加速度至15 m/min，當(dāng)大鼠因停止跑步從皮帶上滑落到15 cm×15 cm的電擊網(wǎng)上時(shí)，會(huì)受到頻率3 Hz，電流1.2 mA的電擊，重復(fù)這個(gè)過(guò)程直到大鼠學(xué)會(huì)在跑臺(tái)上持續(xù)奔跑5 min。第二階段（2 d）：測(cè)定大鼠的耐力跑步能力。起始速度10 m/min，15°坡度，以每2 min 1 m/min的速度加速，直到因大鼠竭力而終止實(shí)驗(yàn)，記錄下跑步距離代表耐力跑步能力。竭力的標(biāo)準(zhǔn)：大鼠因疲勞第3次滑落到電極網(wǎng)上并持續(xù)2 s不愿跑步。

1.2.4 骨骼肌分離提?。号渲?0%的水合氯醛，稱量每只大鼠的體質(zhì)量后，按照0.4 mL/100 g的劑量，經(jīng)腹腔注射麻醉藥，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，迅速分離腓腸肌，分離后的組織一部分迅速放入配置好的4%多聚甲醛固定液中固定24 h，后經(jīng)梯度蔗糖脫水后用OCT包埋。另一部分組織不經(jīng)處理迅速放入-80 ℃冰箱保存。大鼠最后經(jīng)過(guò)量的水合氯醛注射處死，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色：選取10 μm的冰凍切片，置高壓鍋煮沸的枸櫞酸鹽（pH=6.0）修復(fù)液中，約5 min，后常溫放置20～30 min使切片溫度降低。放入PBS中洗3次，每次5 min，用10%山羊血清封閉30 min，甩凈切片上的山羊血清后滴加MHC-I抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），濃度為1∶4 000，4 ℃孵育過(guò)夜；第2天用PBS清洗切片3次，每次5 min，根據(jù)二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）的操作步驟，先用10%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶10 min，經(jīng)PBS清洗后用聚合物輔助劑孵育20 min，再次用PBS清洗后孵育二抗30 min，用DAB顯色液顯色，最后用Olympus顯微鏡觀察并攝取相應(yīng)圖片。

1.2.6 Western blot：取100 mg的腓腸肌充分剪碎，置于1 mL研磨管中，加入含1 mmol/L PMSF和1 mmol/L組織裂解液（RIPA）60～100 μL/20 mg，RIPA∶PMSF=99∶1，置于高速震蕩儀上，震蕩3～4次，每次40 s，間隔5 min。將研磨管置于勻漿器上勻漿，放置于冰上靜置20 min，12 000 r/min，離心15 min。取上清，分裝，-80 ℃保存。備一管用來(lái)測(cè)定蛋白濃度。用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）獲取核蛋白以備核內(nèi)HDAC4測(cè)定。蛋白上樣體系配置：先用BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定蛋白濃度，加雙蒸水及Loadingbuffer配置成上樣體系。配置好后經(jīng)100 ℃ 5 min將體系變性，放入-20 ℃冰箱保存。電泳時(shí)選用8%分離膠進(jìn)行蛋白分離，后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗后，放入經(jīng)稀釋的PGC-1α（美國(guó)Calbiochem公司）、HDAC4（美國(guó)Cell Signaling公司）和MEF-2（美國(guó)Santa Cruz公司）一抗中4 ℃孵育過(guò)夜，抗體稀釋濃度分別為1∶1 000，1∶1 000，1∶200；二抗分別選用山羊抗鼠和山羊抗兔（美國(guó)Biosharp公司）室溫孵育2 h，二抗?jié)舛?∶2 000；內(nèi)參Tubulin（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），稀釋倍數(shù)為1∶2 000。

1.2.7 qRT-PCR：取100 mg組織研磨后加1 mL Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）抽提試劑加入200 μL

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用±s表示，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD（方差齊）或Dunnett’T3（方差不齊）方法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠跑步距離及慢肌纖維比例的比較 NC組與HH組大鼠跑步距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.054）；與HH組比，HE組大鼠的跑步距離明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HH組的慢肌纖維比例較NC組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HE組較HH組慢肌纖維比例明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖1。氯仿/異戊醇（24∶1），振蕩混勻30 s，放置5 min；高速冷凍離心機(jī)離心10 min（12 000 r/min，4 ℃）；抽取上清液轉(zhuǎn)移到去酶的1.5 mL離心管內(nèi)，加入與上清液等體積的異丙醇和1.0 μL的糖原，室溫下放置5 min；再次高速冷凍離心機(jī)離心8 min（12 000 r/min，4 ℃）；移去上清液，用70%乙醇洗滌2次，每次700 μL，再分別離心2 min和5 min（12 000 r/min，4 ℃）；待乙醇揮發(fā)完全后，用20 μL DEPCH2O溶解RNA。檢測(cè)總RNA濃度后嚴(yán)格按照試劑盒中的要求進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)液的配制，反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃，10 min，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；延伸：72 ℃ 1 s，7 min，1個(gè)循環(huán)；冷卻：40 ℃30 s，1個(gè)循環(huán)。

表1 3組大鼠跑步距離和慢肌纖維比例比較（n=8，±s）

表1 3組大鼠跑步距離和慢肌纖維比例比較（n=8，±s）

與NC組比：aP＜0.05；與HH組比：bP＜0.05

NC組 532.0±47.4 88.5±4.1 HH組 406.0±40.2 71.6±2.9a HE組 539.0±44.9b 80.5±3.3b

2.2 腓腸肌中的miR-1表達(dá) HH組miR-1表達(dá)較NC組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HE組miR-1表達(dá)較HH組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HE組miR-1表達(dá)較對(duì)照組同樣增高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 腓腸肌中miR-1相關(guān)蛋白表達(dá) HH組PGC-1α、MEF-2、核內(nèi)HDAC4蛋白表達(dá)均較NC組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HE組核內(nèi)HDAC4、PGC-1α和MEF-2蛋白表達(dá)較HH組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且HE組MEF-2蛋白表達(dá)較NC組仍明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖1 慢肌纖維的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×200，深色部分為慢肌纖維）

圖2 3組大鼠腓腸肌中miR-1表達(dá)（n=8）

圖3 3組腓腸肌中相關(guān)蛋白表達(dá)（n=8）

3 討論

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種由真核生物的核DNA編碼的單鏈RNA分子（18～24個(gè)核苷酸），它不具有編碼功能，但可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制影響基因表達(dá)。MyomiRs在心肌和（或）骨骼肌中高度表達(dá)，是一組可以調(diào)節(jié)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝的特異性miRNAs[10]。近幾年來(lái)，關(guān)于miRNAs相關(guān)分子機(jī)制在COPD骨骼肌功能障礙的作用逐漸引起重視。研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的股四頭肌肌力和步行時(shí)間較正常對(duì)照組明顯下降，同時(shí)COPD患者的股四頭肌存在明顯的肌纖維轉(zhuǎn)變（I型→ II型）和肌萎縮；該研究提出miR-1相關(guān)的IGF-1、SRF和HDAC4信號(hào)通路可能在COPD骨骼肌功能障礙中起到一定作用[11]。HDAC4是miR-1的一個(gè)主要靶蛋白，過(guò)表達(dá)的miR-1會(huì)下調(diào)HDAC4蛋白，從而起到調(diào)節(jié)骨骼肌分化的作用[8]。HDAC4能結(jié)合關(guān)鍵的肌轉(zhuǎn)錄因子MEF-2，HDAC4作為MEF-2依賴性的結(jié)構(gòu)和收縮基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可影響MEF-2表達(dá)[12]。而MEF-2將調(diào)節(jié)PGC-1α：一種與MEF-2蛋白合作的活性轉(zhuǎn)錄因子，作為鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路的一個(gè)靶蛋白[13]，它主要牽涉到慢肌纖維基因的表達(dá)[14]。因此通過(guò)測(cè)定HDAC4可一定程度地反映肌纖維轉(zhuǎn)變的情況。一項(xiàng)研究曾報(bào)道，穩(wěn)定表達(dá)核內(nèi)HDAC4的C2C12細(xì)胞會(huì)分化成大的肌管，具有更強(qiáng)的收縮力，這種收縮經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致其從培養(yǎng)皿上脫落，而這部分分離的肌管會(huì)形成球狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明核內(nèi)HDAC4聚集對(duì)骨骼肌的分化有益[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，HH組大鼠的腓腸肌中核內(nèi)HDAC4蛋白含量下降，miR-1在骨骼肌成肌細(xì)胞中起著抑制HDAC4表達(dá)的作用[16]，這解釋了HH組的miR-1含量越高而核內(nèi)HDAC4含量越低的現(xiàn)象。相應(yīng)地，HDAC4的重要靶蛋白MEF-2，在HH組表達(dá)明顯下降，進(jìn)而影響它的下游蛋白PGC-1α的表現(xiàn)也出現(xiàn)明顯下降。與此同時(shí)，HH組大鼠的腓腸肌出現(xiàn)了慢肌纖維向快肌纖維的轉(zhuǎn)變，提示存在骨骼肌分化。這符合HH組觀察到的大鼠運(yùn)動(dòng)耐力較對(duì)照組稍下降的現(xiàn)象。關(guān)于HH組核內(nèi)HDAC4減少的原因，筆者推測(cè)可能與HDAC4核外流或降解有關(guān)，有待進(jìn)一步研究明確。對(duì)HH組大鼠施加NMES后可觀察到腓腸肌中miR-1的含量較HH組減少，相應(yīng)地，HDAC4-MEF-2-PGC-1α通路的各蛋白表達(dá)均較HH組增多，同時(shí)HE組慢肌纖維比例較HH組明顯增多，即出現(xiàn)快肌纖維向慢肌纖維轉(zhuǎn)變，大鼠跑步距離也較HH組增加，說(shuō)明NMES部分逆轉(zhuǎn)了因CIHH造成的大鼠骨骼肌病理改變，改善了大鼠耐力運(yùn)動(dòng)能力。綜上可以推測(cè)，核內(nèi)HDAC4可能在調(diào)節(jié)肌肉分化中起到積極的作用，并且這種作用可能是通過(guò)影響MEF-2和PGC-1α蛋白發(fā)揮作用的。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是目前緩解COPD骨骼肌功能障礙最有效的干預(yù)措施之一，其效果表現(xiàn)為一系列的生理性適應(yīng)改變，如次極量運(yùn)動(dòng)時(shí)血乳酸水平降低，對(duì)心率和通氣功能的要求降低，形成有效的呼吸模式等，直接結(jié)局就是經(jīng)過(guò)一定運(yùn)動(dòng)循環(huán)的COPD患者可逐步承受更高的活動(dòng)量，維持更長(zhǎng)時(shí)間的次極量活動(dòng)[17]。然而，對(duì)于COPD患者而言，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練最大的限制是患者在運(yùn)動(dòng)時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的呼吸困難，以致無(wú)法在訓(xùn)練中達(dá)到要求的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，而無(wú)法達(dá)到有效的治療。NMES是一種作用于局部骨骼肌的被動(dòng)康復(fù)訓(xùn)練方式，對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響很小，在訓(xùn)練時(shí)也不會(huì)對(duì)心臟產(chǎn)生過(guò)多的負(fù)荷[18]，大大降低了COPD患者康復(fù)訓(xùn)練的門檻。本研究通過(guò)對(duì)COPD模型大鼠骨骼肌施加NMES治療，驗(yàn)證了NMES可作為COPD骨骼肌功能障礙的有效康復(fù)措施，并且進(jìn)一步揭示了NMES的治療作用可能是通過(guò)影響miR-1-HDAC4-MEF-2-PGC-1α信號(hào)通路而發(fā)揮的，為COPD患者的臨床康復(fù)治療提供了有利的理論基礎(chǔ)。

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