ICP-MS測定全血中5種微量元素及其參考區(qū)間的建立

徐鳳仙， 于嘉屏， 吳娟娟

（上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗所研發(fā)實驗室，上海 200433）

人體內(nèi)的微量元素含量處于動態(tài)平衡中，缺乏和過量都會對人體產(chǎn)生不良影響。人體鐵（iron，F(xiàn)e）、鎂（magnesium，Mg）、鈣（calcium，Ca）、鋅（zinc，Zn）、銅（copper，Cu）元素水平的高低與很多疾病及健康息息相關(guān)，如精神分裂[1]、動脈粥樣硬化[2]、阿茲海默癥[3]、早產(chǎn)風(fēng)險[4-5]、新生兒健康[6-7]、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)[8]、慢性疾病[9]、抗氧化保護(hù)[10]等。如何快速、準(zhǔn)確地檢測人體微量元素水平，進(jìn)而推斷與疾病的相關(guān)性成為臨床亟待解決的問題。目前，檢測微量元素的方法有原子吸收光譜法（atomic absorption spectroscopy，AAS）[11]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES）[12]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[13]等。其中ICP-MS以其線性范圍寬、檢測敏感性高、可同時測定多種元素、基質(zhì)效應(yīng)低等特點受到普遍關(guān)注。我們擬建立ICP-MS同時檢測全血中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5種元素的方法，探討ICP-MS用于臨床大樣本檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

安捷倫7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）、BY-400C型醫(yī)用離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）、BSA224SCW型分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、優(yōu)普超純水儀（成都超純科技有限公司）、快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）、Thermo Scientific可調(diào)移液器（美國Thermo公司）等。硝酸（超純級，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司）、Triton 100（美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）。Fe、Mg、Ca、Zn、Cu標(biāo)準(zhǔn)品（可溯源至中國計量科學(xué)研究院）及內(nèi)標(biāo)品鍺（germanium，Ge）由國家有色金屬及電子材料分析檢測中心提供，濃度均為1 000 μg/mL。1 μg/L調(diào)諧液（鈰、鈷、鋰、Mg、鉈、釔混合液，美國安捷倫科技有限公司）

1.2 方法

1.2.1 儀器準(zhǔn)備 儀器按正常程序開機，抽真空，然后在待機情況下進(jìn)行儀器維護(hù)，點火調(diào)諧，性能驗證成功后進(jìn)行批處理調(diào)諧。相關(guān)工作參數(shù)：載氣流速為0.35 L/min，氣流速為0.61 L/min； 等離子體模式，高基質(zhì)系統(tǒng)；等離子體氣流速為15 L/min；采樣深度為10 mm；射頻功率為1 550 W；提取透鏡為-200 V；Omega透鏡電壓為11.0 V；Omega偏轉(zhuǎn)電壓為-70 V；積分時間為0.1 s；重復(fù)次數(shù)為3次；蠕動泵流速為0.1 r/min；氦氣流速為5 L/min。在批處理調(diào)諧相關(guān)參數(shù)達(dá)到分析要求[質(zhì)量軸±0.1、每秒計數(shù)值（counts per second，CPS）＞2 400、氧化物＜1%，雙電荷＜3%]后開始正常分析程序。

1.2.2 采樣前相關(guān)試劑及系統(tǒng)準(zhǔn)備 進(jìn)樣分析前分別對系統(tǒng)中可能引起污染的部件，如霧化器、霧化池、炬管及錐進(jìn)行浸泡清洗，更換管線，每個樣本采集結(jié)束后分別切換至進(jìn)樣口沖洗、稀硝酸溶液及超純水清洗，相關(guān)試劑均用超純水稀釋至對應(yīng)濃度后進(jìn)樣檢測，考察各個元素的干擾情況。每個批次分析前分別進(jìn)樣超純水及稀釋液，排除空白干擾之后再進(jìn)行樣本分析。

1.2.3 稀釋液配制 分別移取2.5 mL硝酸及0.5 mL Triton 100至500 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，然后轉(zhuǎn)移至聚丙稀瓶中，得到含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀釋液，儲存于4 ℃冰箱中待用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液配制 分別移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品母液，參照全血樣本中不同目標(biāo)元素水平進(jìn)行配制，分別得到混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，其中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu水平分別為500、50、125、12.5、3.125 μg/mL。同樣移取適量內(nèi)標(biāo)品配制得到0.5 μg/mL 內(nèi)標(biāo)液，然后分別移取2.5、5、10、20、40 μL母液，加入20 μL內(nèi)標(biāo)液，然后分別定容至1 mL，得到S1、S2、S3、S4、S5 5個濃度，待用。

1.2.5 樣本稀釋準(zhǔn)備 將全血樣本充分混勻，然后準(zhǔn)確移取20 μL全血樣本，加入20 μL內(nèi)標(biāo)液，再加入960 μL含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀釋液，定容至1 mL，充分混勻，采用蠕動泵連續(xù)進(jìn)樣，采集時間為0.1 s。

1.3 方法學(xué)評價

1.3.1 線性評價 將混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液S1～S5按正常程序進(jìn)行處理并進(jìn)樣分析，觀察Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5種元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性。

1.3.2 基質(zhì)效應(yīng)及相關(guān)干擾 分別準(zhǔn)備2個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品（C1），C1為理論濃度，進(jìn)樣分析得到一個檢測值C2。將同樣水平的標(biāo)準(zhǔn)品加入全血樣本中，檢測得到加入量C3，分別進(jìn)樣。平行檢測6份樣本，計算C1、C2與C3的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，即目標(biāo)元素在純稀釋液中與在全血基質(zhì)中結(jié)果的差異，評價基質(zhì)干擾程度。每批標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液檢測結(jié)束之后進(jìn)樣分析空白稀釋液，如果采集記數(shù)超過最低點計數(shù)的20%則繼續(xù)進(jìn)行空白稀釋液分析，直至殘留干擾達(dá)到S1點的20%以內(nèi)。

1.3.3 精密度 分別準(zhǔn)備低、中、高水平混合全血樣本，進(jìn)行6次重復(fù)處理后進(jìn)樣分析，檢測5種元素的水平，觀察批內(nèi)重復(fù)性[以變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示]；準(zhǔn)備低、中、高水平全血樣本，分3批進(jìn)行6次重復(fù)處理（分3 d，每天2批），進(jìn)樣分析，檢測5種元素的水平，觀察批間重復(fù)性（以CV表示）。

1.3.4 添加回收試驗 將1份混合全血樣本平行測定20次，求得本底值L1，在此基礎(chǔ)上添加中水平和高水平標(biāo)準(zhǔn)品得到L2和L3，然后分別檢測L2和L3各元素的水平及對應(yīng)的添加回收率。

1.3.5 室間比對試驗 分別準(zhǔn)備3個不同水平的全血樣本（C1、C2、C3），每個水平進(jìn)行6次進(jìn)樣檢測，將本實驗室的測定結(jié)果與安捷倫科技（中國）有限公司上海分公司實驗室（簡稱安捷倫實驗室）的安捷倫7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的測定結(jié)果進(jìn)行比對，觀察不同實驗室間結(jié)果的差異。

1.3.6 參考區(qū)間的建立 選取2016年7月杭州地區(qū)體檢正常者495名，其中男242名、女253名，年齡2～50歲。按年齡分為≤16歲組（254名）和＞16歲組（241名）。采用肝素鈉抗凝真空采血管采集靜脈全血樣本，充分搖勻，2～8 ℃保存待測，采用ICP-MS檢測5種元素，建立正常人群的參考區(qū)間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，以x ±s表示，組間比較采用t檢驗，以x ±2s方式建立參考區(qū)間。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線性評價及最低定量限（limit of quantitation，LOQ）

以標(biāo)準(zhǔn)點濃度為X，對應(yīng)元素CPS與內(nèi)標(biāo)CPS比率為Y，建立線性回歸方程，r值為0.999 6～1.000 0。5種元素線性均良好。見表1。

重復(fù)檢測超純水11次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為該法的LOQ，見表1。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.7%～6.0%，稀釋之后基質(zhì)對檢測結(jié)果基本無影響。見表2。

2.3 精密度驗證

采用ICP-MS檢測低、中、高水平樣本，F(xiàn)e、Mg、Ca、Zn、Cu的批內(nèi)CV為0.31%～3.62%，批間CV為1.37%～7.15%。見表3。

2.4 添加回收試驗

將L2、L3處理后分別檢測6次，求得L2、L3均值，F(xiàn)e、Mg、Ca、Zn、Cu對應(yīng)的添加回收率為98.2%～112.7%，符合要求（100%±20%）。見表4。

表1 5種元素線性回歸方程及線性范圍

表2 5種元素基質(zhì)效應(yīng)分析

表3 5種元素批內(nèi)、批間CV結(jié)果 （%）

表4 添加回收試驗結(jié)果

2.5 室間比對分析

本實驗室測定結(jié)果與安捷倫實驗室的平均相對偏差為0.61%～5.56%，本方法準(zhǔn)確度滿足要求，可用于大樣本分析。見表5。

表5 室間比對分析結(jié)果

2.6 臨床應(yīng)用及參考區(qū)間統(tǒng)計

男、女性之間5種元素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。按年齡劃分為未成年組（≤16歲）和成年組（＞16歲），成年組與未成年組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。未成年組Cu元素比成年組低1.0%，Ca元素比成年組高8.5%，Mg元素比成年組高4.3%，F(xiàn)e元素比成人組低2.4%，Zn元素比成年組低24.4%。以x ±2s計算參考區(qū)間。見表6、表7。

表6 成年組與未成年組Mg、Ca、Fe、Cu 、Zn結(jié)果的比較 （mg/L，x±s）

表7 Mg、Ca、Fe、Cu、Zn的參考區(qū)間 （mg/L）

3 討論

隨著人們對營養(yǎng)要求關(guān)注的增加，各種食品中或多或少會添加單一元素或復(fù)合元素，以補充人體所需的微量元素[14]。本研究結(jié)果顯示，未成年人Zn水平相對較低，與文獻(xiàn)報道[15-16]一致，因此需引起臨床重視，但也不可盲目補充，應(yīng)結(jié)合相應(yīng)檢測結(jié)果適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行控制或補充。

ICP-MS是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的較新的檢測技術(shù)，其將ICP的高溫電離特性與四極桿質(zhì)譜的高敏感性相結(jié)合，形成一種新型的同位素分析、元素分析和形態(tài)分析技術(shù)，具有檢出線性范圍寬、檢出限低、干擾因素少、基質(zhì)效應(yīng)低、分析精密度高、分析速度快等特性，廣泛應(yīng)用于環(huán)境、化工、食品、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示，ICP-MS檢測全血Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的線性關(guān)系良好，批內(nèi)、批間精密度均符合臨床檢測要求，同時還初步建立了杭州地區(qū)未成年人與成年人全血5種元素的參考區(qū)間。

綜上所述，ICP-MS具有敏感性高、抗干擾能力強、準(zhǔn)確度高及穩(wěn)定性好的優(yōu)點，可同時檢測Fe、Mg、Ca、Zn、Cu元素，而且臨床適用性較好，可為臨床相關(guān)疾病的診斷提供參考依據(jù)。

[1] CAI L，CHEN T，YANG J，et al. Serum trace element differences between Schizophrenia patients and controls in the Han Chinese population[J]. Sci Rep，2015，5：15013.

[2] KOPRIVA D，KISHEEV A，MEENA D，et al. The nature of iron deposits differs between symptomatic and asymptomatic carotid atherosclerotic plaques [J].PLoS One，2015，10（11）：e0143138.

[3] CRISTOVAO J S，SANTOS R，GOMES C M.Metals and neuronal metal binding proteins implicated in Alzheimer's disease[J]. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：9812178.

[4] TERRIN G，BERNI CANANI R，DI CHIARA M，et al. Zinc in early life：a key element in the fetus and preterm neonate[J]. Nutrients，2015，7（12）：10427-10446.

[5] 傅銀鋒，閔玉芳，張一鳴，等. 難免流產(chǎn)胎兒微量元素的調(diào)查研究[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2006，21（3）：219-221.

[6] KHOUSHABI F，SHADAN M，MIRI A，et al.Determination of maternal serum zinc，iron，calcium and magnesium during pregnancy in pregnant women and umbilical cord blood and their association with outcome of pregnancy[J]. Mater Sociomed，2016，28（2）：104-107.

[7] 蔡眉，唐振華，余文. 血鋅、鐵與血常規(guī)檢測在兒童感染和貧血時的變化[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2014，29（11）：1164-1168.

[8] KRUGER P C，YANG K X，PARSONS P J，et al.Abundance and significance of iron，zinc，copper，and calcium in the hearts of patients with Friedreich ataxia[J]. Am J Cardiol，2016，118（1）：127-131.

[9] NICHOLS T A，SPRAKER T R，GIDLEWSKI T，et al. Dietary magnesium and copper affect survival time and neuroinflammation in chronic wasting disease[J]. Prion，2016，10（3）：228-250.

[10] GRIGORESCU R，GRUIA M I，NACEA V，et al.Parameters of oxidative stress variation depending on the concentration of inorganic zinc compounds[J]. J Med Life，2015， 8（4）： 449-451.

[11] 譚昆，王書安，胡焰，等. 火焰原子吸收光譜法測定兒童全血中鐵、鋅、鈣的濃度[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9（5）：112-113.

[12] 高巖，楊英，余波，等. 電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定正常人全血中鐵、銅等10種元素[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（9）：2149-2150.

[13] 李慧源，徐克前，湯郡. 電感耦合等離子質(zhì)譜法檢測兒童末梢血多種元素[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（5）：600-601.

[14] 覃珊，王焱，仰大貴，等. 兒童全血微量元素含量及補充現(xiàn)狀調(diào)查[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2013，28（8）：690-692.

[15] 肖钘，何金花，黎毓光，等. 廣州市番禺區(qū)兒童全血5種微量元素檢測結(jié)果分析[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2013，28（9）：801-804.

[16] 楊華，盧建明，楊曉東，等. 1 100例18歲以下人群全血微量元素檢測結(jié)果分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（8）：929-930.