奧地利發(fā)現(xiàn)與仔豬先天性震顫相關(guān)的新型瘟病毒（Linda病毒）

摘譯自Benjamin Lamp，等， Emerging Infectious Diseases. 2017， 23：1176-1179咸 文，梁海英，曾智勇

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

薦語：仔豬先天性震顫可導(dǎo)致仔豬震顫，無法正常吸吮乳汁，常導(dǎo)致斷奶前仔豬死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大損失，本文介紹了奧地利某豬場暴發(fā)仔豬先天性震顫，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)致病因素為一種新型瘟病病毒種類——Linda病毒。

曾智勇，男，1978年9月生，四川威遠人，博士，貴州大學(xué)教授、碩士研究生導(dǎo)師、貴州大學(xué)學(xué)術(shù)骨干，貴州省科技特派員，黑龍江畜牧獸醫(yī)雜志編委。主要從事動物傳染病及病原分子生物學(xué)相關(guān)研究，以規(guī)?；i場主要病毒性疫病為基礎(chǔ)，開展新型疫苗和病原快速檢測方法及試劑盒的研發(fā)。同時，長期面向豬場開展豬病毒性疫病的抗體監(jiān)測和病原的快速檢測以及規(guī)?；i場疾病防控指導(dǎo)，為豬場提供技術(shù)支持。

主持國家自然科學(xué)基金項目1項，省廳級項目3項；參研貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目5項，其他各類省廳(局)級項目13項；獲“貴州省科學(xué)技術(shù)進步獎三等獎”3項。先后發(fā)表各類學(xué)術(shù)論文180余篇，其中SCI論文3篇，一級學(xué)報論文12篇，核心期刊90余篇；參編養(yǎng)殖技術(shù)叢書3冊，參編專業(yè)類編著2冊，參編《畜牧獸醫(yī)行政管理學(xué)》（國家統(tǒng)編教材）。

2003年在澳大利亞某豬場出現(xiàn)豬的非典型瘟病毒，后被稱為Bungowannah病毒（BV）， 該病毒引起母豬的繁殖障礙，死胎和猝死，由于其明顯的致病性，BV被認為是對全球豬健康事業(yè)最大的威脅，但這種病毒或其類似病毒在其他地方從未發(fā)現(xiàn)過。最近，一組新型的豬瘟病毒在北美被鑒定，稱之為非典型豬瘟病毒（APPV），隨后在歐洲也檢測到該病毒。有充足的證據(jù)表明，APPV是仔豬A-II型先天性震顫（CT A-II）綜合征的致病因子，其特征表現(xiàn)為因腦和脊髓中不同程度的低髓鞘化而引起的全身性震顫。然而，邊界病病毒（BDV），牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）或豬瘟病毒（CSFV）在妊娠晚期感染后，也可導(dǎo)致羊、牛或豬的胎兒腦中出現(xiàn)類似的低髓鞘化。奧地利某農(nóng)場于2015年1月份暴發(fā)了仔豬先天性震顫（CT），造成大量損失，仔豬表現(xiàn)嚴重地橫向震動，常常無法吸吮乳汁，導(dǎo)致斷奶前死亡率升高；CT的發(fā)病率從20%到100%不等。該場發(fā)生CT疫情后，PSY由原來的25.8降低到僅22.4；病理檢查后證實存在典型的CT A-II病理損傷。

然而，利用基于RT-PCR的APPV特異性TaqMan探針，檢測來自該場的不同樣品，其結(jié)果均為陰性。但是應(yīng)用新的瘟病毒屬通用引物（PPF 5'-GTKATHCAATACCCTGARGC-3'和PPR 5'-GGRTTCCAGGARTACATCA-3'），通過RTPCR從CT仔豬血清樣品擴增，獲得了一定長度的擴增產(chǎn)物，該通用引物也能夠用于檢測CSFV，BVDV-1，BVDV-2，BDV，BV和APPV。該擴增產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，是一段具有連續(xù)性開放閱讀框的未知序列，核苷酸BLAST比對結(jié)果顯示未見有相似性序列，但翻譯后的270aa序列卻與不同的瘟病毒相關(guān)序列排序一致。在CT仔豬及其同窩仔豬的所有樣本（血清，扁桃體，肺，肝，脾和中樞神經(jīng)系統(tǒng)材料）中均檢測到病毒RNA。

將CT仔豬血清樣品接種SK-6細胞后，采用RT-PCR能檢測到未知瘟病毒的核酸。為避免與其他瘟病毒混淆，暫時將該致病因子其命名為“Linda”（誘導(dǎo)神經(jīng)組織損傷導(dǎo)致橫向震顫的致病因子），利用標準引物進行RT-PCR擴增獲得了Linda病毒（LV）的全基因組，并上傳至GenBank（登錄號KY436034），其長度為12 614 bp，具有381 bp的5'-非翻譯區(qū)，11 772 bp的開放閱讀框和461 bp的3'-非翻譯區(qū)。利用CLC Workbench 7.6對LV進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)LV與APPV之間的相似性僅有60%，與BV之間的相似性為68%。LV與BV氨基酸序列相似性為69%，與其他瘟病毒的氨基酸相似性＜54%。LV中含有所有已知的NS3蛋白酶裂解位點；位于典型豬瘟病毒的L/A、BV的L/S位點上的NS4A-NS4B裂解位點，在LV中被定位于L2354/S2355位點處；在LV中，分子內(nèi)NS3切割位點（L1834/A1835）系保守位點，每種推導(dǎo)的成熟蛋白與BV成熟蛋白匹的配度最好。將Linda病毒（GenBank登錄號KY436034）的核苷酸（圖1）和氨基酸（圖2）序列分別進行遺傳進化樹分析，其均與Bungowannah病毒（登錄號EF100713.2）處在同一進化分支上，同源性較近。而標準瘟病毒BVDV-1（登錄號M31182.1）、BVDV-2（登錄號U18059.1）和BVDV-3（登錄號AB871953.1）處于同一進化分支；CSFV（登錄號X87939.1）和綿羊瘟病毒（登錄號：NC_018713.1）處在同一進化分支上；BDV（登錄號AF037405.1 ）和馴鹿瘟病毒（登錄號AF144618.2）則位于同一進化分支上，上述三個分支共屬于一個較大分支，與LV病毒所屬分支較遠，同源性也較遠。

圖1 核苷酸遺傳進化樹分析

被稱為6A5的BVDV E2特異性抗體對LV感染細胞有很強的反應(yīng)性。在Western印跡分析中，該抗體可與LV的E1-E2異二聚體（75kDa）以及E2單體（50kDa）反應(yīng)，但與BVDV-1 E2的反應(yīng)性更強。利用該抗體，可在體外對LV的增殖進行很好的研究。SK-6 和MDBK細胞在被接種LV后，LV E2抗原信號可在其細胞質(zhì)中被檢測到，但在SK-6細胞中的E2抗原陽性病灶比MDBK細胞大10倍。在接種的豬原代細胞懸液中，LV感染滴度可大于107TCID50。利用單克隆抗體6A5進行免疫組化分析，可在患CT仔豬的組織學(xué)病變區(qū)域中檢測到陽性抗原。三叉神經(jīng)核、小腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞和腦白質(zhì)、腎臟腎小管上皮的神經(jīng)元特異性染色結(jié)果證明瘟病毒可以穿過血腦屏障。但是在胎兒發(fā)育過程中，瘟病毒誘導(dǎo)鞘內(nèi)脫髓鞘的機制仍不清楚。

圖2 氨基酸遺傳進化分析

通過在CT仔豬脊髓的整個白質(zhì)中觀察到嚴重的鞘內(nèi)脫髓鞘病變，在腦中檢測到瘟病毒抗原，表明瘟病毒感染和病變之間存在因果關(guān)系。與幾乎不感染培養(yǎng)細胞的APPV相比，LV與BV類似，可以很容易地在豬細胞系上增殖而不需要適應(yīng)過程，因而認為LV可能與BV有共同的祖先。大約10年前，BV就在全球范圍內(nèi)得到了廣泛的關(guān)注，但目前在澳大利亞境外從未被發(fā)現(xiàn)過。由于BV廣泛的細胞嗜性，進而提出了關(guān)于該病毒系跨種感染豬的假說。E2特異性單克隆抗體6A5的交叉反應(yīng)鑒別實驗結(jié)果表明，其與各瘟病毒的蛋白存在交叉反應(yīng)性，這可能會干擾CSFV的血清學(xué)檢測。LV在歐洲的流行病學(xué)情況，其對實驗動物的毒力評估，仍需要進一步的調(diào)查和研究。