母豬繁殖性能相關(guān)5個候選基因的PCR-RFLP多態(tài)性研究

吳華莉，涂尾龍，曹建國，3，都啟晶，常 華，羊兆洪 ，談永松*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；2上海市調(diào)控生物學(xué)重點實驗室，上海200241；3上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海201302；4青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島266109；5云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)，昆明650201；6淮安洪泰良種豬繁育有限公司，淮安223472）

豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和出生窩重是母豬重要的繁殖性狀，與眾多調(diào)控基因有關(guān)。目前學(xué)者們針對豬繁殖性狀相關(guān)基因開展研究，如雌激素受體（Oestrogen receptor，ESR）、含凝血酶敏感蛋白模體的去解聯(lián)金屬蛋白酶1基因（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-1，ADAMTS1）、巖藻糖轉(zhuǎn)移酶1基因（α1，2-fucosyl transferase，F(xiàn)UT1）、核受體輔激活蛋白 1（Nuclear receptor co-activator 1，NCOA1）和視黃醇結(jié)合蛋白4基因（Retinol-binding proteins 4，RBP4）等［1］。ESR通過與雌激素的作用促進(jìn)細(xì)胞合成，參與陰道上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化［2］。ADAMTS1在豬卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中表達(dá)，體外培養(yǎng)的作用是促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟［3］。NCOA1是類固醇受體的輔助激活劑家族成員，NCOA1和NCOA3共同作用調(diào)控胎盤的形態(tài)變化和胚胎存活［4］。FUT1基因M307位存在A/G突變，導(dǎo)致丙氨酸突變蘇氨酸，從而顯著減少FUT1酶的活性，引起GG和AG型個體對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）F18敏感，而AA基因型則表現(xiàn)為抗性［5］。有研究報道證實FUT1基因AA型斷奶仔豬成活率高于BB型的2倍，可作為提高斷奶仔豬成活率的分子標(biāo)記［6-7］。RBP4基因在囊胚擴張時期的表達(dá)量增加，并且在懷孕10—12 d的母豬子宮內(nèi)膜也呈現(xiàn)高表達(dá)［8-9］。此外，RBP4基因也被發(fā)現(xiàn)是孕體植入前的主要分泌產(chǎn)物［10］。

本研究采用PCR-RFLP方法檢測ESR、NCOA1、ADAMTS1、FUT1和RBP4基因在杜洛克、長白和大白群體中的基因型頻率和等位基因頻率，并分析它們與豬總產(chǎn)仔數(shù)（Total number born，TNB）、產(chǎn)活仔數(shù)（Number born alive，NBA）和出生窩重（Birth litter weight，BLW）的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗用豬及樣品

來自上海祥欣畜禽有限公司有杜洛克（100頭）、大白（150頭）和長白（80頭），10月齡母豬，用于本試驗5個基因的多態(tài)性分析。采集的豬耳組織塊置于75%酒精中帶回實驗室。采用AXYGEN試劑盒（上海鼎盛生物科技有限公司）提取DNA并測定濃度，檢測合格的樣品放入－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

收集生產(chǎn)記錄包括耳號、TNB、NBA和BLW。針對每個樣品對應(yīng)5個基因的不同基因型和生產(chǎn)性能記錄進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、比對和估計最小二乘均值等處理。

1.2 PCR-RFLP分析

使用特異性引物擴增5個基因的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖檢測，要求目的條帶清晰明亮且無雜帶，方可進(jìn)行相應(yīng)酶切試驗。5個基因PCR擴增引物序列，染色體位置，退火溫度和對應(yīng)內(nèi)切酶見表1。酶切體系（20μL）：6μL PCR產(chǎn)物、5 U限制性內(nèi)切酶0.5μL、Buffer 1μL和ddH2O 12.5μL。限制性內(nèi)切酶購于Fermentas和寶生物工程有限公司。

1.3 統(tǒng)計方法

計算出每個SNP基因頻率和等位基因頻率，雜合度的計算公式：H＝1－∑pi。

1.4 PCR產(chǎn)物酶切與分型

使用1.5%瓊脂糖電泳檢測5個基因PCR擴增產(chǎn)物。使用2.5%瓊脂糖電泳檢測酶切后產(chǎn)物。不同基因型分別選取3個樣品進(jìn)行測序。根據(jù)電泳圖譜和測序結(jié)果進(jìn)行基因型分型。5個基因不同基因型判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 5個基因PCR擴增引物序列、染色體位置、退火溫度和對應(yīng)內(nèi)切酶Table 1 The primer sequences，chromosomal locations，temperatures，and endonucleases of five genes

表2 5個基因PCR產(chǎn)物酶切與帶型Table2 Restriction digestion patterns of five gene PCR products bp

1.5 統(tǒng)計分析

計算5個基因在3個豬群體內(nèi)的基因型頻率和基因頻率。采用SPSS軟件進(jìn)行5個基因不同基因型TNB、NBA和BLW差異比較分析。Yijk＝μ+gk+eijk，yijk表示繁殖性狀（TNB、NBA和BLW），μ為群體均值，gk為基因效應(yīng)，eijk為隨機殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個基因在3個豬群體內(nèi)的基因型頻率與基因頻率

5個基因在3個豬群體內(nèi)的基因型頻率和等位基因頻率見表3。

表3 5個基因在3個豬群體中的基因型頻率與等位基因頻率Table 3 Genotype and allele frequencies of five genes in three pig groups

ESR基因在杜洛克群體內(nèi)只檢測出AA型，在長白群體內(nèi)，檢測出AA型（0.94）和AB型（0.06）；在大白群體內(nèi)檢測出AA型（0.54）、BB型（0.03）和AB型（0.43）；在長白和大白群體內(nèi)A等位基因頻率均高于B等位基因頻率。NCOA1基因在杜洛克群體內(nèi)檢測出AA型（0.59）、BB型（0.05）和AB型（0.36）；在大白群體內(nèi)檢測出AA型（0.78）、BB型（0.05）和AB型（0.17）；在長白群體內(nèi)只檢測出AA型；在3個豬群體內(nèi)A等位基因頻率均高于B等位基因頻率。ADAMTS1基因在杜洛克群體內(nèi)檢測出AA型（0.37）、BB型（0.13）和 AB型（0.50）；在長白群體內(nèi)檢測出 AA型（0.14）、BB型（0.40）和 AB型（0.46）；在大白群體內(nèi)檢測出AA型（0.10）、BB型（0.46）和AB型（0.44）；除了在杜洛克群體外，B等位基因頻率均高于A等位基因頻率。FUT1基因在杜洛克群體內(nèi)檢測出AA型（0.16）、BB型（0.44）和AB型（0.40）；在長白群體內(nèi)檢測出BB型（0.79）和AB型（0.21）；在大白群體內(nèi)檢測出AA型（0.03）、BB型（0.57）和AB型（0.40）；在3個豬群體內(nèi)B等位基因頻率均高于A等位基因頻率。RBP4基因在杜洛克群體內(nèi)檢測出AA型（0.68）、BB型（0.14）和AB型（0.18）；在長白群體內(nèi)檢測出 AA型（0.41）、BB型（0.21）和 AB型（0.38）；在大白群體內(nèi)檢測出AA型（0.25）、BB型（0.47）和AB型（0.28）；除了大白豬群體外，A等位基因頻率均高于B等位基因頻率。表3中各基因的基因型頻率經(jīng)χ2檢驗均不顯著，符合哈代-溫伯格平衡定律。

2.2 5個基因不同基因型TNB、NBA和BLW在3個豬群體內(nèi)差異比較

5個基因不同基因型在3個豬群體的TNB、NBA和BLW差異比較分析見表4、表5和表6。

表4 5個基因?qū)Χ怕蹇薚NB、NBA和BLW影響Table 4 The influence of five genes to Duroc TNB，NBA and BLW

表5 5個基因?qū)﹂L白TNB、NBA和BLW影響Table 5 The influence of five genes to landrace TNB，NBA and BLW

在長白群體內(nèi)ESR基因AB型的TNB、NBA、BLW比AA型的分別高0.36頭、0.44頭和87 g（P＞0.05）；在大白群體內(nèi)BB型的TNB、NBA、BLW比AA型的分別高0.36頭、0.41頭和98 g（P＞0.05）。在大白群體內(nèi)BB型的TNB、NBA和BLW最高；在杜洛克群體內(nèi)只檢測出AA型。

NCOA1基因在杜洛克和大白群體內(nèi)TNB、NBA和BLW都表現(xiàn)AA型＞AB型＞BB型的趨勢。在杜洛克群體內(nèi)AA型的3個指標(biāo)比BB型的分別高1.18（P＜0.01）、1.11頭（P＜0.01）和102 g（P＞0.05）；在大白群體內(nèi)AA型的TNB、NBA、BLW比BB型的分別高0.53頭（P＜0.05）、1.92頭（P＜0.01）和102 g（P＞0.05）；在長白群體內(nèi)只檢測出AA型。

ADAMTS1基因在杜洛克、長白和大白群體內(nèi)TNB、NBA和BLW都表現(xiàn)AB型＞BB型＞AA型的趨勢。在杜洛克群體內(nèi)AB型的TNB、NBA、BLW比AA型的分別高0.83頭（P＜0.05）、0.55頭（P＜0.05）和31 g（P＞0.05）；在長白群體內(nèi)AB型的3個指標(biāo)比AA型的分別高0.67頭（P＜0.05）、0.86頭（P＜0.05）和107 g（P＞0.05）；在大白群體內(nèi)AB型的3個指標(biāo)比AA型的分別高0.88頭（P＜0.05）、0.54頭（P＜0.05）和56 g（P＞0.05）。

FUT1基因在杜洛克和大白群體內(nèi)TNB、NBA和BLW都表現(xiàn)AA型＞AB型＞BB型趨勢。在杜洛克群體內(nèi)AA型的TNB、NBA、BLW比BB型的分別高0.47頭（P＞0.05）、0.76頭（P＜0.05）和89 g（P＞0.05）；在大白群體內(nèi)AA型的3個指標(biāo)比BB型的分別高0.56（P＜0.05）、1.06頭（P＜0.01）和108 g（P＞0.05）；在長白群體內(nèi)AB型的3個指標(biāo)比BB型的分別高0.17頭、0.39頭和104 g（P＞0.05）。

RBP4基因在杜洛克、長白和大白群體內(nèi)TNB、NBA和BLW都表現(xiàn)AA型＞AB型＞型BB趨勢。在杜洛克群體內(nèi)AA型TNB、NBA、BLW比BB型的分別高0.53（P＜0.05）、1.1頭（P＜0.01），和98 g（P＞0.05）；在長白群體內(nèi)AA型的3個指標(biāo)比BB型的分別高0.64頭（P＜0.05）、0.35頭和87 g（P＞0.05）；在大白群體內(nèi)AA型的3個指標(biāo)比BB型的分別高0.86（P＜0.05）、1.29頭（P＜0.01）和107 g（P＞0.05）。

表6 5個基因?qū)Υ蟀譚NB、NBA和BLW影響Table 6 The influence of five genes to large white TNB，NBA and BLW

3 討論

3.1 ESR基因?qū)ωi繁殖性能的影響

目前國內(nèi)外學(xué)者有關(guān)ESR基因?qū)ωi產(chǎn)仔數(shù)影響的報道中存在不同觀點。普遍認(rèn)為，ESR基因不同基因型的繁殖性能表現(xiàn)為BB＞AB＞AA［11-13］。ESR基因Pvu II位點B等位基因能提高豬產(chǎn)仔數(shù)［1］。Short等［14］提出ESR基因B等位基因來源于中國豬種，后來經(jīng)過與西方豬種雜交選育而存在。Rothschild等［1］證實ESR基因等位基因B與TNB相關(guān)聯(lián)，BB型初產(chǎn)TNB和NBA比AA型的多2.3頭（P＜0.01），所有胎次多1.5頭（P＜0.01），他也證實ESR基因?qū)γ飞截iTNB和NBA影響達(dá)到顯著水平，然而該基因?qū)Χ怕蹇恕㈤L白和大白TNB和NBA影響不顯著（P＞0.05）。而Hunyadi-Bagi等［15］最新報道指出ESR基因在匈牙利大白、杜洛克和皮特蘭豬群體內(nèi)只檢測出AA型和AB型，AA型的TNB和NBA比AB型的高。本研究結(jié)果顯示，ESR基因在大白群體內(nèi)BB型的TNB和NBA比AA型和AB型多，但差異不顯著（P＞0.05）。這與蘇一等［16］、Rothschild等［17］研究證實B等位基因為優(yōu)勢等位基因的結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示ESR基因在3個豬群體內(nèi)AA型頻率較高，且在杜洛克群體內(nèi)未檢測出BB型。

3.2 NCOA1基因?qū)ωi繁殖性能的影響

NCOA1基因是類固醇受體共激活劑家族成員，這類輔助激活物并不直接綁定DNA發(fā)生作用，而是通過招募核激素受體啟動子來發(fā)揮作用［18］。NCOA1基因與NCOA3基因協(xié)同作用，通過調(diào)控過氧化物酶體復(fù)合物受體家族維持胎盤形成和妊娠中期胚胎存活，同時敲出這兩個基因會導(dǎo)致胎盤形成受阻和妊娠中期的高致死率［4］。這說明NCOA1基因與胚胎存活有關(guān)。本研究檢測出NCOA1基因?qū)Χ怕蹇撕痛蟀兹后w的繁殖性能影響表現(xiàn)為：AA＞AB＞BB型，在長白群體內(nèi)只檢測到AA型。在杜洛克和大白群體內(nèi)NCOA1基因AA型 NBA比 BB型的多，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。這與魯慧文等［19］、李永輝［20］、Melville等［21］的研究結(jié)果一致。

3.3 ADAMTS1基因?qū)ωi繁殖性能的影響

ADAMTS1為細(xì)胞外蛋白酶，在孕酮受體激活時由顆粒細(xì)胞中合成和分泌，從而促進(jìn)排卵［22-23］。ADAMTS1基因不僅參與排卵，也在體外卵母細(xì)胞成熟過程中起重要作用［24］。本研究檢測ADAMTS l基因在杜洛克、長白和大白群體內(nèi)AB型TNB和NBA比AA型的高，達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05）；在長白和大白群體內(nèi)AB型BLW比AA型的高，未達(dá)到差異顯著水平（P＞0.05）。本研究結(jié)果顯示ADAMTS l基因在3個群體的繁殖性能影響表現(xiàn)為AB＞BB＞AA趨勢。這與徐珊珊等證實AB型屬于優(yōu)勢基因型的結(jié)果一致［25］。

3.4 FUT1基因?qū)ωi繁殖性能的影響

張引紅等［26］研究表明FUT1基因多態(tài)性對豬TNB影響顯著（P＜0.05），對NBA影響不顯著（P＞0.05）。Kyungtae等［7］證實FUT1基因AA型斷奶仔豬成活率高于BB型的。有報道指出FUT1基因GG和AG型對ETEC F18敏感，AA型為抗性［27］。本研究結(jié)果顯示AA型TNB、NBA和BLW均高于AB型和BB型。盡管FUT1基因AA型仔豬成活率較高的原因未明，但FUT1基因可以抵抗傳染病的研究報道已被證實［28，5］。這可能與豬的抗病性能提高從而提高NBA有關(guān)，所以在育種過程有必要關(guān)注FUT1基因AA型的比例。

3.5 RBP4基因?qū)ωi繁殖性能的影響

RBP4基因在胚胎發(fā)育時期發(fā)揮作用［29］。大多數(shù)有關(guān)RBP4基因報道證實AA型和A等位基因?qū)ωiTNB和NBA有正向影響［30-34］，但也有學(xué)者指出BB型比AA型和AB型有高的產(chǎn)仔數(shù)，且B等位基因來源高產(chǎn)仔性能的中國豬種［35-37］。在本研究結(jié)果顯示：在杜洛克、長白和大白群體內(nèi)AA型TNB、NBA、BLW比BB型的高，尤其在大白群體中AA型NBA比BB型的多1.1頭，達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01）。RBP4基因不同基因型的繁殖性能表現(xiàn)為AA＞AB＞BB的趨勢，且A等位基因是影響3個豬群體繁殖性狀的優(yōu)勢等位基因。

3.6 5個基因?qū)?個豬群體繁殖性能影響效應(yīng)比較

本研究結(jié)果表明5個基因?qū)?個豬群體繁殖性能影響程度存在差異，影響較大的是NCOA1和RBP4基因，其次是FUT1基因和ADAMTS1基因，最小的是ESR基因。NCOA1基因?qū)Χ怕蹇巳后w的TNB和NBA、大白群體NBA影響達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01），對大白群體TNB影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。RBP4基因?qū)Χ怕蹇撕痛蟀兹后wNBA影響達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01），對3個豬群體TNB影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。FUT1基因?qū)Υ蟀譔BA影響達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01），對杜洛克群體TNB、NBA和大白群體TNB影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。ADAMTS1基因?qū)?個群體TNB、NBA影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。ESR基因?qū)?個豬群體TNB、NBA影響未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

造成差異原因可能與基因效應(yīng)大小有關(guān)，NCOA1基因可以直接和間接影響豬胚胎的存活。本研究顯示NCOA1基因和RBP4基因優(yōu)勢基因型都是AA型，這2個基因AA型頻率在杜洛克、長白、大白群體中分別為0.59、1、0.78和0.68、0.41、0.25，可作為豬繁殖性能的輔助選擇標(biāo)記。最新研究證實FUT1基因AA型仔豬有較高的成活率［25］。本研究顯示FUT1基因AA型頻率在杜洛克和大白群體中分別為0.16和0.03，而在長白群體中未檢測出AA型，這暗示著3個豬群體的斷奶仔豬成活率或許不同，但這一推論需要進(jìn)一步試驗加以證實。ADAMTS l基因AB型為優(yōu)勢基因型，在杜洛克、長白、大白群體內(nèi)頻率分別為0.50、0.46和0.44，呈現(xiàn)中度多態(tài)，可作為豬繁殖性能的輔助選擇標(biāo)記。ESR基因有利基因型BB型在大白群體中頻率0.03，在杜洛克和長白群體中未檢測出BB型，這也可能是ESR基因?qū)?個豬群體繁殖性能影響不大的原因。總之，5個基因的不同基因型對3個豬群體TNB和NBA影響可達(dá)到差異顯著或者極顯著水平，但它們對BLW影響未達(dá)到差異顯著水平。

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