五福飲治療膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型實驗研究

王敏龍 盧德趙 葉興法 錢木水 沈欽榮

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是最常見的關(guān)節(jié)疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高、治療花費高以及易反復(fù)的特點[1]。近年來，中藥復(fù)方以其多靶點、多途徑的治療優(yōu)勢發(fā)揮著重要的臨床作用[2]。目前治療多以“補腎活血學(xué)說”、“經(jīng)筋理論”為依據(jù)，以滋補肝腎、祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、循經(jīng)用藥為治則[3]。本課題組通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，人體五臟虛損的變化與OA發(fā)生有密切聯(lián)系，并運用“五臟同補”代表方五福飲對其治療，取得不錯療效[4]。為探討其可能的作用機制，以Hulth法復(fù)制KOA模型，觀察五福飲顆粒劑對KOA大鼠炎癥因子及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）的影響，為“五臟同補”治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供實驗室依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（220±18）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供（許可證號：SCXK（滬）2008-0016）。動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)鼠類SPF級實驗室（合格證號：SXYK（浙）2013-0184），飼養(yǎng)溫度 20～23℃，濕度 50%～60%，光照每12h明暗交替，通風(fēng)8～15次/h，自由飲食并保證充足的飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分組實驗。

1.2 藥 物 五福飲顆粒劑：黨參、熟地、白術(shù)、當(dāng)歸、甘草按 3：3：2：2：1 比例配制，五福飲顆粒劑由浙江紹興景岳堂制藥公司提供，顆粒劑1g相當(dāng)于煎劑藥量5g。

1.3 試 劑 鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Cloud-Clone Corp公司，批號：SEA563Ra），鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Cloud-Clone Corp公司，批號SEA079Ra），廣譜二抗（上海長島生物技術(shù)有限公司，批號D-3004），辣根過氧化酶（上海長島生物技術(shù)有限公司，批號A1820），DAB濃縮型試劑盒（上海長島生物技術(shù)有限公司，批號FL-6001），中性樹脂（上海長島生物技術(shù)有限公司，批號：G8590），兔抗大鼠 BMP-2（美國 Abeam 公司，批號 ab14933）。

1.4 儀 器 超低溫冷凍儲存箱（DW-MW138，中科美菱低溫科技股份有限公司），旋渦振蕩器（K30，青浦瀘西儀器廠），生化培養(yǎng)箱（LRH-250A，廣州航信科學(xué)儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M3，美國 Molecular Devices公司），正置顯微鏡（CX41，日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會社），恒溫烘箱（DHG-9023A，上海恒一科學(xué)儀器有限公司），石蠟切片機（SQ2125，湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司），攤片機（Ppthk21B，湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司），IMS圖象分析系統(tǒng)（浙江中醫(yī)藥大學(xué)），數(shù)碼相機（D5100，日本NIKON公司），臺式高速冷凍離心機（Eppendorf-5417R，深圳市賽亞泰科儀器設(shè)備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 健康SPF級雄性大鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組10只和造模組20只。造模組大鼠稱重后，常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，Hulth造模法[5]建立KOA模型，取大鼠右膝內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，剪斷前后交叉韌帶，再完整剔除內(nèi)側(cè)半月板。假手術(shù)組只做切口暴露關(guān)節(jié)后縫合。術(shù)后給予青霉素4萬U肌肉注射，1天2次，連續(xù)3天。術(shù)后隨機按數(shù)字表法將造模組20只分成模型組10只和治療組10只。各組在實驗過程中未出現(xiàn)脫落。5只1籠進行喂養(yǎng)，術(shù)后1周強迫各組大鼠每天活動1小時，連續(xù)驅(qū)趕4周。

2.2 藥物干預(yù) 大鼠藥物用量換算[5]采用人和動物的體表面積計算法，人為大鼠的1/6。五福飲顆粒劑成人0.44g/（kg·d），則大鼠為2.64g/（kg·d）。治療組在造模6周后按2.64g/（kg·d）灌胃，其余各組按10mL/kg蒸餾水灌胃，1天1次，灌胃4周。

2.3 ELISA法檢測各組大鼠血清及關(guān)節(jié)液IL-1β和IL-6濃度 各組藥物干預(yù)結(jié)束1周后，用2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，腹主動脈取血5～10mL置于抗凝管內(nèi)，靜置30min后，放入3000r/min的離心機，離心15min取血清。處死大鼠立即切取各組大鼠右膝關(guān)節(jié)，打開關(guān)節(jié)囊，用2mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，取約2cm直徑10mL一次性無菌尿杯，上置0.25μm一次性過濾器收集關(guān)節(jié)沖洗液，移液器轉(zhuǎn)移至2.5mL EP管，離心5min，取上清液約1mL。指標(biāo)測定按照ELISA檢測試劑盒說明書進行。在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一和第二孔中分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，接著加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；然后從第一孔和第二孔中各取100μL分別加到第三、四孔，以此類推至第九、十孔，混勻后從第九、十孔中各取50μL棄掉。在酶標(biāo)包被板待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再滴加待測樣品10μL（樣品最終稀釋濃度為5倍）。將樣品滴加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑）。用封板膜封板后置37℃溫育30min，洗滌5次，每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，再溫育，洗滌，顯色，在酶標(biāo)儀上于450nm波長處以陰性對照孔調(diào)零，檢測各孔光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的檢測結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組樣品的實際濃度。

2.4 免疫組化檢測大鼠關(guān)節(jié)軟骨BMP-2表達情況關(guān)節(jié)液收集完后立即用4%中性多聚甲醛固定膝關(guān)節(jié)標(biāo)本48h，接著用10%EDTA-2Na對標(biāo)本脫鈣4周，當(dāng)大頭針可以無阻力穿透標(biāo)本時確認(rèn)脫鈣成功，修剪標(biāo)本，脫水、石蠟包埋后，右側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁矢狀面切片，二甲苯脫蠟；梯度乙醇脫水；復(fù)合抗原修復(fù)液（0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液），50℃孵育15min；3%H2O2中室溫孵育10min；含1%牛血清白蛋白（BSA）抗體稀釋液稀釋的一抗BMP-2（1∶200），陰性對照以PBS代替一抗，4℃孵育過夜；滴加辣根過氧化酶標(biāo)記廣譜二抗工作液，37℃孵育30min；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；二甲苯透明，封片，拍片。在400倍鏡下每份樣本隨機選取5個視野，獲取圖像并編號、存盤。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）免疫組化染色陽性結(jié)果呈棕黃色，在胞漿表達，主要分布于關(guān)節(jié)軟骨中層和深層。采用Image-Pro Plus軟件，計算陽性染色平均光密度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析組間差異，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Tamhane’s T2法，若不滿足正態(tài)性時采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠血清及關(guān)節(jié)液IL-1β和IL-6濃度比較 與假手術(shù)組比，模型組和治療組血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β和IL-6的濃度均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，治療組血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β和IL-6的濃度均有顯著下降（P＜0.01），見表 1～2。

3.2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞BMP-2表達比較 模型組軟骨中BMP-2表達水平低于假手術(shù)組（P＜0.01），使用五福飲顆粒劑治療后，治療組表達比模型組明顯升高（P＜0.01），與假手術(shù)組無明顯差異（P＞0.05）見封二圖 1、2。

4 討論

KOA 歸屬于中醫(yī)“痹癥”、“骨痹”、“膝痹”、“痿證”或“痿痹”等范疇，病機為本虛標(biāo)實，肝腎不足、正氣虧虛是其本，風(fēng)寒濕邪入侵，痰濁內(nèi)蘊，瘀血阻滯經(jīng)絡(luò)為其標(biāo)，即“本痿標(biāo)痹”[6]。KOA是一種退行性病變，其患病率隨著年齡的增長明顯升高，且在診斷標(biāo)準(zhǔn)中明確指出“中老年患者（＞40歲）”為診斷成立的條件之一。可見，增齡衰老是KOA較為確切的發(fā)病危險因素。中醫(yī)認(rèn)為該病多見于中老年以后，肝氣衰，筋不能動，進而腎臟衰，形體皆極。臨床多見筋急而攣，膝軟活動不利，或痿軟而肌力減退等，因而認(rèn)為其病機為“本痿”。“痿證”是肢體筋脈弛緩，手足痿軟無力，肌肉萎縮，不能隨意運動的一種病癥。陳無擇指出“人身有皮毛、血脈、筋膜、肌肉、骨髓，以成其形，內(nèi)則有肝、心、脾、肺、腎以主之，若隨情妄用，喜怒勞佚，以致內(nèi)臟精血虛耗，使血脈、筋骨、肌肉痿弱無力以運動，故致痿躄，狀與柔風(fēng)腳氣相類。柔風(fēng)腳氣，皆外因風(fēng)寒，正氣與邪氣相搏，故作腫苦痛，為邪實；痿由內(nèi)臟不足之所致，但不任用，亦無痛楚，此血氣之虛也”，強調(diào)痿乃內(nèi)臟不足，血氣之虛所致。故五臟虛損，血氣空虛，不榮四末為“痿”病機。中醫(yī)強調(diào)治病求本，故而提出“五臟同補”治療KOA的觀點。

表1 各組大鼠血清IL-1β和IL-6濃度比較（μg/L，x±s）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)液IL-1β和IL-6濃度比較（μg/L，x±s）

五臟同補的整體觀，源于五行五藏、五臟互藏理論。五行五藏，是指五行中的任何一行包括其他四行。張景岳五行五藏的觀點，將五行與陰陽緊密結(jié)合起來，提出“五行即陰陽之質(zhì)，陰陽即五行之氣，氣非質(zhì)不力，質(zhì)非氣不行”（《類經(jīng)圖翼·運氣·五行統(tǒng)論》），將五行與五臟結(jié)合起來，即形成了五臟互藏理論[4]?！毒霸廊珪ぞ砹っ}神章》曰：“凡五臟之氣必互相灌溉，故五臟之中，必各兼五氣?！蓖瑫r又指出：“有一臟之偏強，常致欺凌他臟者；有一臟之偏弱；每因受制多虞者。”（《景岳全書·卷二·傳忠錄·臟象別論》）五福飲為明代著名醫(yī)家張景岳創(chuàng)制的五臟同補代表方名方，見于《景岳全書·新方八陣·補陣》，由人參、熟地黃、當(dāng)歸、白術(shù)、炙甘草組成，主治五臟氣血虧損，其中人參補氣、養(yǎng)心、養(yǎng)神、生津；熟地質(zhì)潤入腎，為補腎陰之要藥；當(dāng)歸補血、活血、養(yǎng)肝；白術(shù)益氣、健脾、補肺；炙甘草和中補脾、潤肺、解毒、調(diào)和諸藥。五藥同用，共奏補益五臟氣血之功。實驗中人參用黨參代替，黨參具有補氣、養(yǎng)血之效。張景岳稱“凡五臟氣血虧損者，此能兼治之，足稱王道之最”。

白細(xì)胞介素-1（IL-1）家族主要包括IL-1α和IL-1β 兩種亞型，以 IL-1β 為主。研究[7]表明，IL-1β在OA患者關(guān)節(jié)液呈高水平表達，且與關(guān)節(jié)軟骨損傷成正相關(guān)。其可影響軟骨細(xì)胞基因的表達抑制軟骨的合成代謝[8-9]，同時通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達與活化，促進軟骨細(xì)胞的分解代謝[10]。IL-1β可刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生大量NO[11]，通過caspase-8、P38及ERK1/2途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[12]。此外還可上調(diào)促進軟骨細(xì)胞衰老的Caveolin-1 mRNA和蛋白質(zhì)水平，加速OA進程[13]。因此，IL-1β被認(rèn)為是OA病理過程中促進軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要細(xì)胞因子[14]。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是另一種重要的炎癥介質(zhì)，正常軟骨細(xì)胞可產(chǎn)生少量IL-6，高水平時可使軟骨及軟骨下骨結(jié)構(gòu)改變，刺激軟骨細(xì)胞增殖，導(dǎo)致骨贅形成[15]。研究[16]證實，IL-6可刺激滑膜增生，激活破骨細(xì)胞，形成滑膜血管翳及釋放MMPs，從而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)和軟骨的破壞。其可與IL-1協(xié)同抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)缺失[17]。

BMP-2是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）超家族成員，是正常胚胎期骨組織及成年期骨修復(fù)中的重要蛋白分子[18]。研究[19]表明，BMP-2可刺激軟骨蛋白多糖的合成、誘導(dǎo)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)新生軟骨細(xì)胞表型，使新生軟骨內(nèi)的蛋白多糖和膠原纖維含量更趨近正常[20]，同時可長期維持體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表型，加速全層關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，改善修復(fù)軟骨組織質(zhì)量[21]。有學(xué)者研究[22]認(rèn)為，BMP-2與骨贅的形成有關(guān)，但體外給予不同劑量BMP-2導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎骨贅的研究表明了其導(dǎo)致骨贅的作用是有限的[23]。

本實驗表明，使用五福飲顆粒劑可降低KOA大鼠血清和關(guān)節(jié)液 IL-1β、IL-6 含量（P＜0.01），減輕炎癥反應(yīng)，同時上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨中BMP-2表達（P＜0.01），促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，從而延緩KOA進程（P＜0.01）。本實驗存在樣本量少，觀察周期短，未對劑量探討的不足，將在下一步的研究中改進。

［1］邱貴興.骨關(guān)節(jié)炎流行病學(xué)和病因?qū)W新進展［J］.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2005，19（7）：68-69.

［2］劉獻祥.基于陳可冀學(xué)術(shù)思想之骨性關(guān)節(jié)炎研究［J］.康復(fù)學(xué)報，2016，26（1）：2-5.

［3］劉獻祥.中醫(yī)藥治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的研究現(xiàn)狀［J］.中醫(yī)正骨，2012，24（1）：3-7.

［4］葉正從，沈欽榮，王敏龍.五福飲治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察［J］.中國中醫(yī)藥科技，2016，23（5）：608-609.

［5］章元沛.藥理學(xué)實驗（第2版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：238.

［6］李西海，劉獻祥.骨關(guān)節(jié)炎的核心病機——本痿標(biāo)痹［J］.中醫(yī)雜志，2014，55（14）：1248-1249，1252.

［7］ Marks PH，Donaldson MLC.Inflammatory Cytokine Profiles Associated With Chondral Damage in the Anterior Cruciate Ligament-Deficient Knee［J］.Arthroscopy：The Journal of Arthroscopic&Related Surgery，2005，21（11）：1342-1347.

［8］Aigner T，Mckenna L，Zien A，et al.Gene expression profiling of serum-and interleukin-1β-stimulated primary human adult articular chondrocytes-A molecular analysis based on chondrocytes isolated from one donor［J］.Cytokine，2005，31（3）：227-240.

［9］ Tew SR，Li Y，Pothacharoen P，et al.Retroviral transduction with SOX9 enhances re-expression of the chondrocyte phenotype in passaged osteoarthritic human articular chondrocytes［J］.Osteoarthritis and Cartilage，2005，13（1）：80-89.

［10］ Wang X，Li F，F(xiàn)an C，et al.Effects and relationship of ERK1 and ERK2 in interleukin-1beta-induced alterations in MMP3，MMP13，type II collagen and aggrecan expression in human chondrocytes［J］.Int J Mol Med，2011，27（4）：583-589.

［11］ Blanco FJ，Ochs RL，Schwarz H，et al.Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide［J］.Am J Pathol，1995，146（1）：75-85.

［12］賀牡丹，王小平，陳同生.白介素-1β誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的分子機理［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2011，33（1）：49-54.

［13］ Dai S，Shan Z，Nakamura H，et al.Catabolic stress induces features of chondrocyte senescence through overexpression of caveolin 1：Possible involvement of caveolin 1-induced down-regulation of articular chondrocytes in the pathogenesis of osteoarthritis［J］.Arthritis&Rheumatism，2006，54（3）：818-831.

［14］ Kobayashi M，Squires GR，Mousa A，et al.Role of interleukin-1 and tumor necrosis factor α in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage

［J］.Arthritis&Rheu-matism，2005，52（1）：128-135.

［15］金粉勤，薛鋒.膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清TNF-a與IL-6水平檢測分析［J］.中國實驗診斷學(xué)，2014，18（3）：461-462.

［16］ Gerter R，Kruegel J，Miosge N.New insights into cartilage repair-The role of migratory progenitor cells in osteoarthritis［J］.Matrix Biology，2012，31（3）：206-213.

［17］羅玉明，鄭維篷，魏合偉.骨關(guān)節(jié)炎與細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 關(guān)系的研究進展［J］.現(xiàn)代診斷與治療，2013，24（2）：326-327.

［18］Chen D，Zhao M，Mundy GR.Bone Morphogenetic Proteins［J］.Growth Factors，2009，22（4）：233-241.

［19］ Blaney DE，Vitters EL，van Lent PL，et al.Elevated extracellular matrix production and degradation upon bone morphogenetic protein-2 （BMP-2）stimulation point toward a role for BMP-2 in cartilage repair and remodeling［J］.Arthritis Res Ther，2007，9（5）：R102.

［20］Papathanasiou I，Malizos KN，Tsezou A.Bone morphogenetic protein-2-induced Wnt/beta-catenin signaling pathway activation through enhanced low-density-lipoprotein receptor-related protein 5 catabolic activity contributes to hypertrophy in osteoarthritic chondrocytes［J］.Arthritis Res Ther，2012，14（2）：R82.

［21］符來想.負(fù)載BMP-2組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（4）：590-593.

［22］Blaney DE，Vitters EL，van der Kraan PM，et al.Expression of transforming growth factor-beta （TGFbeta） and the TGFbeta signalling molecule SMAD-2P in spontaneous and instability-induced osteoarthritis：role in cartilage degradation，chondrogenesis and osteophyte formation［J］.Ann Rheum Dis，2006，65（11）：1414-1421.

［23］ Davidson ENB，Vitters EL，van Beuningen HM，et al.Resemblance of osteophytes in experimental osteoarthritis to transforming growth factor β-induced osteophytes：Limited role of bone morphogenetic protein in early osteoarthritic osteophyte formation［J］.Arthritis&Rheumatism，2007，56（12）：4065-4073.