花生衣多酚物質(zhì)H PLC分析及表兒茶素、兒茶素含量測定

（玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，云南玉溪653100）

花生衣化學成分研究較早的有張秀堯等[1]的研究表明花生衣中含有原花色苷和D（+）-兒茶素。Lou Hongxiang等[2]的研究表明花生衣中含有表兒茶素、兒茶素類以及原花青素B2、B3和B4。諸多研究[3-7]表明花生衣中含有多種酚酸類、原花青素類以及黃酮類等多種多酚類成分。中醫(yī)認為花生衣具有止血、補血的作用，現(xiàn)代營養(yǎng)學認為花生衣具有抗氧化、清除自由基、抑菌、降血壓等多種生理功效，這方面研究已報道較多[8-10]?；ㄉ碌目寡趸然钚灾饕捎谒ㄇ嗨仡?、白藜蘆醇以及黃酮類等物質(zhì)[11-14]。表兒茶素與兒茶素屬于原花青素中重要的單體，而槲皮素與蘆丁也屬于極具有生物活性的黃酮醇。目前兒茶素及表兒茶素含量測定多見于茶葉及一些中藥成分分析中[15-18]，花生衣中兒茶素、表兒茶素等成分的分析與含量測定僅見個別報道[19]，黃酮類及其他酚酸類報道也極少。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）多見于分離分析葡萄籽中原花青素類物質(zhì)[20-21]，液相色譜-質(zhì)譜法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，HPLC-MS）多用于研究原花青素類單體、低聚體成分[22-23]。本試驗采用HPLC法以多種標準品為對照分析了云南玉溪本地白、紅兩種花生衣中酚酸類物質(zhì)、原花青素單體中表兒茶素與兒茶素、黃酮類等成分，并測定了兩種花生衣中表兒茶素與兒茶素的含量，為花生衣成分的針對性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白、紅花生：玉溪本地超市或農(nóng)貿(mào)市場購買；表兒茶素、兒茶素、槲皮素、蘆丁、綠原酸：均為分析標準品UV≥95%，上海金穗生物科技有限公司；沒食子酸：優(yōu)級純，酷爾生物；鞣酸、無水乙醇：優(yōu)級純，天津鳳船化學試劑科技有限公司；甲醇、乙腈：色譜純，Tedia company，USA；超純水：玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院光譜實驗室自制。

1.2 儀器設(shè)備

LC-10A高效液相色譜儀、shimpack VP-ODS，C-18（15 cm×4.6 mm）色譜柱、UV2550紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州有限公司）；JL-180DT超聲波清洗器：上海吉理超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析條件

1）分析波長選擇：通過UV-2550光譜顯示，表兒茶素、兒茶素及鞣酸在280 nm處均有最大吸收峰，沒食子酸在261 nm處有最大吸收峰，而綠原酸在327 nm處有最大吸收峰，因此實驗以280 nm為表兒茶素、兒茶素、綠原酸、鞣酸及沒食子酸的分析波長；槲皮素在375 nm處有最大吸收峰，蘆丁在360 nm處有最大吸收峰，UV光譜圖像顯示二者在280 nm波長下吸收值均很小，故槲皮素與蘆丁分析波長定為360 nm。

2）流動相：表兒茶素、兒茶素、綠原酸、鞣酸及沒食子酸：乙腈-0.5%乙酸（10∶90，體積比）；槲皮素與蘆丁：甲醇-0.5%乙酸（45∶55，體積比）。

3）流速、柱溫與進樣量：流速均為1.0 mL/min，柱溫均為30℃（夏天當?shù)厥覝亟咏?0℃），進樣量均為 20 μL。

1.3.2 花生衣分析液的制備

稱取花生衣粉0.500 0 g于100 mL棕色容量瓶中，按照花生衣多酚提取方法[24]用約80 mL60%的乙醇溶液在55℃下超聲波輔助提取20 min，冷卻后定容至100 mL，過濾至100 mL棕色容量瓶中（置冰箱中儲存可使用一周），濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

1.3.3 標準品溶液的配制

分別將各標準品20 mg（表兒茶素、兒茶素、槲皮素、蘆丁、綠原酸）用無水乙醇配制成0.200 mg/mL的儲備液，再稀釋至一定濃度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后使用。其中表兒茶素與兒茶素配成濃度為0.003、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050 mg/mL的標準系列。鞣酸（乙醇配制）與沒食子酸（水配制）各稱取0.010 0 g，分別配制成0.100 mg/mL的儲備液，再稀釋至一定濃度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后使用。各標準品儲備液均以棕色容量瓶保存在冰箱中。

1.3.4 HPLC分析方法的建立

試驗采用不同比例的流動相對樣品及標準品反復(fù)進行HPLC分離試驗。以不同比例的乙腈-0.5%乙酸進行表兒茶素、兒茶素、綠原酸、鞣酸及沒食子酸的分離分析，以不同比例的甲醇-0.5%乙酸進行槲皮素與蘆丁的分離分析，一方面要求花生衣樣品各色譜峰能完全分離，另一方面要求目標物的保留時間不要太長。對樣品中目標物及相應(yīng)對照品保留時間的確定采取兩次以上重復(fù)進樣，若樣品目標物峰的周圍有其他干擾峰，還采用標準加入法來定性，以確保分析的準確性。

1.3.5 表兒茶素與兒茶素標準曲線制作及在花生衣中含量分析

試驗以峰面積（mV·min）為橫坐標（x），質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標（y）制作表兒茶素與兒茶素的標準曲線，以此為對照測定樣品中表兒茶素與兒茶素濃度，含量計算方法如下：

式中：c為測得樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）；m為試驗稱取花生衣的質(zhì)量，g。

1.3.6 表兒茶素精密度與加標回收率實驗

由于在花生衣HPLC分析中僅有紅花生衣中檢出兒茶素，試驗僅對表兒茶素進行精密度與加標回收率分析。精密度試驗計算：對花生衣樣品溶液連續(xù)進樣5次的峰面積及保留時間的RSD值。加標回收率試驗設(shè)計方法為：取5 mL花生衣樣品溶液與5 mL表兒茶素標準品溶液，將二者混合，再檢測混合液中表兒茶素濃度?；厥章式Y(jié)果按照以下公式計算：

式中：c混合為混合溶液質(zhì)量濃度，（mg/mL）；c樣品為花生衣樣品溶液質(zhì)量濃度，（mg/mL）；c標樣為表兒茶素標準品溶液質(zhì)量濃度，（mg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件與方法因素分析

2.1.1 流動相因素分析：

對于表兒茶素、兒茶素、綠原酸、鞣酸及沒食子酸的分析，在280 nm波長下流動相以乙腈-0.5%乙酸的不同比例進行實驗。試驗結(jié)果顯示，若流動相中乙腈的比例小于8%，隨著乙腈比例的減小表兒茶素與兒茶素的保留時間逐漸變長，不利于分析，或者乙腈濃度更低時兒茶素與表兒茶素均不出峰；當乙腈比例為10%時，表兒茶素與兒茶素能完全分離，花生衣樣品在70 min內(nèi)所有出峰完成；當乙腈比例為15%及以上時表兒茶素與兒茶素出峰時間明顯縮短，且二者不能完全分離，所以流動相乙腈比例選擇10%較為合理。另外，在此流動相條件下考慮實驗?zāi)繕宋锉Ａ魰r間均在20 min內(nèi)，為縮短樣品分析時間，在20 min以后采取梯度洗脫。

對于槲皮素與蘆丁的分析，在360 nm波長下流動相以甲醇-0.5%乙酸的不同比例來試驗，結(jié)果顯示，當甲醇比例為30%時，槲皮素不出峰，蘆丁保留時間約為27 min，當為40%時，蘆丁與槲皮素保留時間較長均超過20 min，當為45%時，二者保留時間均小于15 min，樣品中槲皮素與蘆丁也均與其他物質(zhì)完全分離，所以流動相甲醇比例選擇45%較為合適。

2.1.2 保留時間與加入標準法定性分析

由于樣品中綠原酸的峰很低，同時其峰的周圍有其他峰的影響而不易判斷，所以定性分析采用保留時間與樣品中加入綠原酸標準品的方法來分析，同時綠原酸標樣與花生衣樣品為同一天的某時段連續(xù)進樣分析。

2.2 花生衣中各多酚物質(zhì)HPLC分析結(jié)果

在280 nm波長下各標準品（表兒茶素、兒茶素、綠原酸、沒食子酸、鞣酸）以及花生衣樣品HPLC圖見圖1～圖2。

圖1280 nm波長下標準品HPLC圖Fig.1 The HPLC chromatogram of standard sample detected at 280 nm

圖2280 nm波長下花生衣HPLC圖Fig.2 The HPLC chromatogram of peanut skin detected at 280 nm

通過標準品與樣品HPLC圖像分析可知，白、紅兩種花生衣中均含有表兒茶素及少量綠原酸，紅花生衣中還含有少量兒茶素，而白花生衣中不含兒茶素，或者含量太低未檢出；兩種花生衣中均不含鞣酸與沒食子酸，這與前人個別研究報道有差異。

圖3 槲皮素、蘆丁標準品HPLC圖Fig.3 The HPLC chromatogram of quermination and rutin standard sample

在360 nm波長下標準品槲皮素與蘆丁及花生衣樣品HPLC圖見圖3～圖4。

圖4 花生衣HPLC圖Fig.4 The HPLC chromatogram of peanut skin

通過標準品與樣品HPLC圖像分析可知，白、紅兩種花生衣中均含有槲皮素與蘆丁，同時通過峰高可以初步判斷紅花生衣中槲皮素與蘆丁含量均明顯高于白花生衣中含量。

另外試驗還用國標法對白、紅兩種花生衣進行白藜蘆醇的提取與色譜分析，用100 mL80%的乙醇提取0.5 g花生衣中的白藜蘆醇，結(jié)果在提取液中并未檢測到白藜蘆醇，說明本地白、紅兩種花生衣白藜蘆醇含量遠遠低于表兒茶素等物質(zhì)含量。

2.3 花生衣中表兒茶素與兒茶素含量分析

2.3.1 表兒茶素與兒茶素標準曲線制作結(jié)果

表兒茶素與兒茶素的峰面積-濃度的標準曲線制作結(jié)果見圖5，表兒茶素方程式為y=（3.661 77×10-7x+1.088 52×10-3，r=0.998 123 8；兒茶素方程式為 y=3.381 17×10-7x+2.682 08×10-5，r=0.998 559 8。

圖5 表兒茶素與兒茶素標準曲線Fig.5 HPLC standard curve of epicatechin and catechin

以表兒茶素與兒茶素標準曲線為對照測定花生衣中表兒茶素與兒茶素的質(zhì)量濃度，并計算含量，結(jié)果見表1。

表1 花生衣中表兒茶素、兒茶素含量Table 1 Content of epicatechin and catechin in peanut skin

通過分析可知紅花生衣中表兒茶素含量略低于白花生衣中含量，而紅花生衣中表兒茶素含量約為兒茶素含量的7倍多。

2.3.2 精密度與加標回收率試驗分析結(jié)果

精密度實驗結(jié)果見表2。

該方法精密度分析峰面積RSD為3.52%，濃度RSD為2.99%，說明該方法重現(xiàn)性好。加標回收率試驗結(jié)果見表3。

表2 表兒茶素精密度試驗結(jié)果Table 2 Result of precision test for epicatechin determination

表3 表兒茶素加標回收率試驗結(jié)果Table 3 Result of recovery test for epicatechin determination

其中最低加標回收率為96.23%，最高為106.93%，平均加標回收率為101.43%，基本符合色譜分析加標回收率要求，說明該色譜分析方法測得數(shù)據(jù)基本準確，結(jié)果也較為可靠。

3 結(jié)論與討論

花生衣多酚類物質(zhì)的HPLC分析，在280 nm波長下以乙腈-0.5%乙酸（10∶90，體積比）為流動相能對兒茶素、表兒茶素等原花青素類單體以及酚酸類物質(zhì)有較好的分離效果，采用該方法分析花生衣中表兒茶素含量時，峰面積及濃度RSD分別為3.52%及2.99%，說明該方法分析數(shù)據(jù)可靠；另外，兩種花生衣HPLC圖像顯示，在此色譜分析條件下花生衣中還有其他幾種多酚類物質(zhì)也明顯被分離，而且色譜峰較高，這為花生衣中其他多酚類物質(zhì)的分析與檢測研究提供了參考依據(jù)；以甲醇-0.5%乙酸（45∶55，體積比）為流動相在花生衣中同時檢測出槲皮素與蘆丁，方法簡單可行；本地白、紅兩種花生衣中表兒茶素、兒茶素含量，以及槲皮素、蘆丁兩種黃酮醇含量有不同的差異，這為進一步研究不同品種花生衣中表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等兒茶素類以及原花青素B2[6]等含量的差異提供一定的理論依據(jù)。

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