響應(yīng)面優(yōu)化米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備A C E抑制肽條件

李景，陳定剛

（1.天津天獅學院生物與食品工程學院，天津301700；2.金天源食品科技（天津）有限公司，天津300452）

高血壓是我國人群腦卒中及冠心病發(fā)病的首位危險因素，嚴重危害人群健康，我國高血壓患者已超過2.7億，并以每年1 000萬人的速度遞增，高血壓的預(yù)防和治療已成為迫切需要解決的重大醫(yī)學和社會問題[1]，臨床上使用的抗高血壓藥物存在一定的副作用[2]，而食源性ACE抑制肽具有較強的降壓活性和良好的安全性[3-5]。我國大豆資源豐富，豆粕作為大豆油加工副產(chǎn)品，其蛋白較高約為48%左右，營養(yǎng)價值較高[6]，但卻一直作為飼料應(yīng)用，附加值較低，若豆粕可作為制備ACE抑制肽的原料，其利用價值可大大提高。

目前研究食源性ACE抑制肽的制備方法主要集中在酶法和微生物發(fā)酵法，發(fā)酵法可利用微生物在食品發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶水解原料蛋白得到ACE抑制肽，成本低廉、工藝過程簡便、條件溫和[7]，固態(tài)發(fā)酵更有培養(yǎng)基簡單、產(chǎn)率高、耗能低、環(huán)境污染少、適合規(guī)模制備等優(yōu)點[8]，而以豆粕為原料制備ACE抑制肽主要集中在酶法[9-11]，微生物發(fā)酵法則較少報道。米曲霉作為美國食品藥品監(jiān)督管理局公布的安全菌株廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[12]，且米曲霉在生長過程中所產(chǎn)蛋白酶較多[13-14]，因而可利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽。

本文以豆粕為原料，米曲霉為發(fā)酵菌種，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽的條件，以期為豆粕的深加工及微生物發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae 3.4437）：中國微生物普通微生物保藏管理中心；豆粕（蛋白質(zhì)含量為48.74%）：金天源食品科技（天津）有限公司；馬尿酰-組胺酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、Gly-Gly-Tyr-Arg四肽：美國 Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16KR離心機：長沙東旺試驗儀器有限公司；SB-300DTDN萬能粉碎機：上海永久中藥機械制造有限公司；XMTD-204電熱恒溫水浴鍋：天津歐諾儀器儀表有限公司；YP1201N電子天平：賽多利斯科學儀器公司；SW-CJ-2G凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；MJ-78A高壓蒸汽滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；BPX-52電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV1000紫外可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

斜面培養(yǎng)基：硝酸鈉3.0 g，蔗糖30.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鐵0.01 g，磷酸氫二鉀1.0 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1.0 L，pH 6.0，115 ℃滅菌 20 min。無菌操作條件下轉(zhuǎn)接保藏菌種至斜面，于30℃恒溫培養(yǎng)96 h，轉(zhuǎn)接2次～3次，至其充分活化。

1.3.2 孢子菌懸液的制備

無菌操作條件下，以10 mL無菌生理鹽水沖洗已活化的米曲霉培養(yǎng)斜面，制成孢子懸液，混勻后用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)，并稀釋調(diào)整懸液的孢子數(shù)為107個/mL。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在前期研究的基礎(chǔ)上，確定米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分為：豆粕（粉碎過60目篩）10 g，麩皮5 g。調(diào)整培養(yǎng)基水分含量為50%，121℃滅菌20 min。取制備好的菌懸液，按一定的接種量（g/100 g，以干基計）接入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。取發(fā)酵培養(yǎng)物5 g，加入200 mL蒸餾水，在25℃、200 r/min條件下水浴振蕩2 h，5 000 r/min條件下離心20min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾作為ACE抑制肽樣品溶液[15]。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)物多肽得率的測定

取ACE抑制肽樣品溶液2.5 mL，加入2.5 mL的10%三氯乙酸水溶液，混勻后靜置10 min，在4 000 r/min條件下離心20 min后，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中并用5%的三氯乙酸液定容。吸取6.0 mL溶液至試管，加入雙縮脲試劑4.0 mL，混合均勻后靜置10 min，在2 000 r/min條件下離心10 min后，取上清液于540 nm處測定吸光度值，對照Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準曲線（圖1），求出樣品溶液中的多肽質(zhì)量濃度（mg/mL），進而求出樣品中的多肽得率[16]（見公式）。由Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準曲線，得到回歸方程y=0.153 3x+0.003 2，R2=0.997 6，呈現(xiàn)良好線性。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準曲線Fig.1 The standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg

1.3.5 ACE抑制率測定

采用紫外分光光度法，參照文獻[17]進行測定。

1.3.6 單因素試驗

1）含水量的影響：分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基水分含量 45%、50%、55%、60%、65%，接種量為 6%，30℃發(fā)酵培養(yǎng)60 h后，測定其發(fā)酵培養(yǎng)物的多肽得率和ACE抑制率，確定培養(yǎng)基最佳含水量。

2）接種量的影響：調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基水分含量為55%，接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，30℃發(fā)酵培養(yǎng)60 h后，測定其發(fā)酵培養(yǎng)物的多肽得率和ACE抑制率，確定培養(yǎng)基最佳接種量。

3）發(fā)酵溫度的影響：發(fā)酵培養(yǎng)基水分含量調(diào)整為55%，接種量為6%，發(fā)酵溫度分別為26、28、30、32、34℃，發(fā)酵培養(yǎng)60 h后，測定其發(fā)酵培養(yǎng)物的多肽得率和ACE抑制率，確定培養(yǎng)基最佳發(fā)酵溫度。

4）發(fā)酵時間的影響：發(fā)酵培養(yǎng)基水分含量調(diào)整為55%，接種量為6%，發(fā)酵溫度30℃，分別發(fā)酵培養(yǎng) 36、48、60、72、84 h 后，測定其發(fā)酵培養(yǎng)物的多肽得率和ACE抑制率，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)時間。

1.3.7 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，確定中心組合試驗因素與水平，并以ACE抑制率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化米曲霉發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽的發(fā)酵條件。因素水平及編碼表見表1。

表1 因素水平及編碼表Table 1 The table of factors and levels

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Desigh-Expert 8.0.6和Origin進行數(shù)據(jù)處理與分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 含水量的影響

米曲霉屬于好氣性真菌，氧氣對于米曲霉的生長和代謝起到重要作用，在培養(yǎng)基質(zhì)量一致的前提下，培養(yǎng)基含水量直接影響氧氣的供應(yīng)，同時水分也是微生物生長代謝的重要物質(zhì)，因此將發(fā)酵培養(yǎng)基含水量作為考查因素之一。含水量對多肽得率和ACE抑制率的影響見圖2。

圖2 含水量對多肽得率和ACE抑制率的影響Fig.2 The effect of water content on peptide yield and ACE inhibition ratio

圖2可知，當發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為55%時，多肽得率和ACE抑制率最高，在此條件下最適宜進行發(fā)酵培養(yǎng)制備ACE抑制肽。發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為45%和50%時，多肽得率和ACE抑制率最低，可能由于含水量較低，可溶性營養(yǎng)物質(zhì)的溶解不充分，影響米曲霉的正常生長。發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為60%和65%時多肽得率和ACE抑制率略低，可能是由于含水量過高，影響發(fā)酵培養(yǎng)基通氣量[18]，米曲霉的生長和產(chǎn)酶能力受限，進而影響多肽得率及ACE抑制率。

2.1.2 接種量的影響

接種量決定了微生物在培養(yǎng)基中生長繁殖的速度，較大的接種量可使米曲霉菌絲繁殖很快到達高峰，減少雜菌生長，但接種量過大或過小，均對發(fā)酵不利。接種量過大，培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗過大，代謝廢物過多，影響多肽得率和ACE抑制率；接種量過小在一定的培養(yǎng)時間條件下，菌體的生產(chǎn)效率較低，多肽得率和ACE抑制率也較低。接種量對多肽得率和ACE抑制率的影響見圖3。由圖3可知，接種量選取6%為宜。

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素，每種微生物都有其特定的最適宜生長的溫度范圍，溫度過高或過低都會影響米曲霉的生長。發(fā)酵溫度對多肽得率和ACE抑制率的影響見圖4。

由圖4可知，多肽得率和ACE抑制率在發(fā)酵溫度為30℃時最高，分別為19.5%和50.98%。溫度過低，米曲霉生長緩慢，蛋白酶活力降低；溫度過高，米曲霉菌絲體老化過快，加速死亡，生長代謝受干擾，產(chǎn)蛋白酶活力降低。

圖3 接種量對多肽得率和ACE抑制率的影響Fig.3 The effect of inoculation quantity on peptide yield and ACE inhibition ratio

圖4 發(fā)酵溫度對多肽得率和ACE抑制率的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature on peptide yield and ACE inhibition ratio

2.1.4 發(fā)酵時間的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵過程影響顯著，發(fā)酵時間過短，菌種生長有限，產(chǎn)酶不多，發(fā)酵不完全；發(fā)酵時間過長，發(fā)酵過度，菌體可利用營養(yǎng)成分較少，代謝廢物過多，菌體老化，產(chǎn)酶減少，影響多肽得率和ACE抑制率。發(fā)酵時間對多肽得率和ACE抑制率的影響見圖5。

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，多肽得率和ACE抑制率隨之升高，超過60 h后，多肽得率和ACE抑制率升高不明顯，發(fā)酵時間到達84 h時，多肽得率和ACE抑制率略有降低，為節(jié)省能耗，綜合考量發(fā)酵時間選取60 h。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及回歸模型的建立

圖5 發(fā)酵時間對多肽得率和ACE抑制率的影響Fig.5 The effect of fermentation time on peptide yield and ACE inhibition ratio

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，確定發(fā)酵時間為60h，選取較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量、接種量、發(fā)酵溫度3個因素為響應(yīng)變量，以ACE抑制率為響應(yīng)值。依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取3個中心點，設(shè)計三因素三水平試驗15組，試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Thedesignandresultsoftheresponse surfaceexperimental

對表2進行回歸分析，以ACE抑制率為響應(yīng)值建立的二次響應(yīng)面回歸方程如下：

對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3方差分析可知，回歸模型P<0.01，說明該模型極顯著，一次項中A、C極顯著（P<0.01），說明單因素中發(fā)酵溫度和發(fā)酵培養(yǎng)基含水量對ACE抑制率有極顯著的影響。二次項A2、C2及交互作用項中AC影響極顯著（P<0.01），表明發(fā)酵溫度和含水量對ACE抑制率有交互影響的作用。失擬項（P=0.242 5）不顯著，殘差由隨機誤差引起。模型校正決定系數(shù)Radj2=0.977 6，說明模型能解釋97.76%響應(yīng)值變化；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.977 6，說明回歸方程擬合度好，可用于本試驗發(fā)酵條件預(yù)測。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance

2.2.2 各因素之間交互作用對ACE抑制率的影響

各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響見圖6～圖8。

圖6 發(fā)酵溫度和接種量對ACE抑制率的影響Fig.6 Response surface for the effect of fermentation temperature and inoculation quantity on ACE inhibition ratio

圖8更清晰的反映出發(fā)酵溫度和含水量對ACE抑制率影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡峭，發(fā)酵溫度和含水量之間有明顯的交互作用，這與表3的方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果一致。

2.2.3 驗證試驗

圖7 接種量和含水量對ACE抑制率的影響Fig.7 Response surface for the effect of inoculation quantity and water content on ACE inhibition ratio

圖8 發(fā)酵溫度和含水量對ACE抑制率的影響Fig.8 Response surface for the effect of fermentation temperature and water content on ACE inhibition ratio

依據(jù)回歸方程獲得了米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽的最優(yōu)發(fā)酵條件，為發(fā)酵溫度29.55℃，接種量6.62%，含水量55.77%，在此條件下ACE抑制率的理論值為56.16%。為驗證模型的預(yù)測準確性，考慮到實際操作的方便性，選取發(fā)酵溫度30℃，接種量7%，含水量56%，在此條件進行3次平行試驗，測得ACE抑制率為56.03%，與理論預(yù)測值基本吻合，說明響應(yīng)面分析方法對米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽的條件優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

微生物發(fā)酵法為制備食源性ACE抑制肽常用方法，主要是利用微生物生長代謝所產(chǎn)生的蛋白酶分解原料蛋白而獲得，該法條件溫和、操作方便等優(yōu)點，采用固態(tài)發(fā)酵更有成本較低，能耗低，不需要廢水處理，對環(huán)境污染小[19]的優(yōu)點。

以多肽得率和ACE抑制率為指標，通過單因素試驗考查發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量和含水量單因素對米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽的影響，確定發(fā)酵時間為60 h。利用響應(yīng)面分析方法Box-Behnken中心組合試驗，以ACE抑制率為指標優(yōu)化米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽條件，擬合了發(fā)酵溫度、接種量和含水量對ACE抑制率影響的回歸模型，結(jié)果表明模型擬合度好，發(fā)酵溫度和發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對ACE抑制率影響極顯著，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，接種量7%，含水量56%，發(fā)酵時間60 h，在此條件下ACE抑制率達到56.03%，與理論預(yù)測值基本吻合，說明響應(yīng)面分析方法對米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽條件的優(yōu)化是可行的。

本研究以產(chǎn)蛋白酶能力較強的米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽，優(yōu)化后其ACE抑制率比酶法水解豆粕所得ACE抑制率略低[9]，但差距不大，說明此方法具有一定的可行性和利用價值，存在差距原因與進一步的優(yōu)化均有待研究。

[1]康玉明,李宏寶,齊杰,等.高血壓中樞發(fā)病機制的研究進展[J].西安交通大學學報(醫(yī)學版),2017,38(1):1-6

[2]陽遠舟,黃維義.抗高血壓藥物的評價與研究進展[J].中外醫(yī)學研究,2016,14(7):161-162

[3]Elliott P,Stamler J,Dyer AR,et al.Association between protein intake and blood pressure[J].Arch Intern Med,2006,166(1):79-87

[4]Iwaniak A,Minkiewicz P,Darewicz M.Food-Originating ACE Inhibitors,Including Antihypertensive Peptides,as Preventive Food Components in Blood Pressure Reduction[J].Compr.Rev.Food Science and Food Safety,2014,13(2):114-134

[5]Rho SJ,Lee JS,Chung YI,et al.Purificationand identification of an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from fermented soybean extract[J].Process Biochemistry,2009,44(4):490-493

[6]盧亞萍,馮杰.大豆多肽的性質(zhì)及其研究進展[J].飼料研究,2005(11):26-29

[7]蔡高峰,黃紀念,孫強,等.大豆降壓肽的制備、純化及活性分析方法研究進展[J].中國食物與營養(yǎng),2009(10):25-27

[8]黃達明,吳其飛,陸建明,等.固態(tài)發(fā)酵技術(shù)及其設(shè)備的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(6):87-91

[9]溫雪琴,劉屾,黃弢,等.大豆粕堿性蛋白酶水解肽及ACE抑制活性的研究[J].食品研究與開發(fā),2014(9):9-12

[10]吳非,于勝男,李良,等.大豆降血壓活性肽和抗癌活性肽的制備研究[J].中國油脂,2011,36(7):58-61

[11]于勝男,吳非.制備大豆降血壓肽最佳用酶的篩選[J].食品工業(yè)科技,2010(5):199-201

[12]劉麗萍,劉麗華.米曲霉研究進展與應(yīng)用[J].中國調(diào)味品,2008,33(4):28-32

[13]李詩雯.米曲霉蛋白酶系協(xié)同水解大豆蛋白的研究[D].武漢:湖北工業(yè)大學,2015

[14]李秀婷,趙進,魯緋,等.米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件及酶活力研究[J].中國釀造,2009(2):26-28

[15]劉曉艷,于純淼,國立東,等.固態(tài)發(fā)酵高溫豆粕制備多肽飼料的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件研究[J].大豆科學,2011,30(2):285-289

[16]魯偉,任國譜,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J].食品科學,2005,26(7):169-171

[17]Zhejie Bao,Yujie Chi.In Vitro and In Vivo Assessment of Angiotensin-Converting Enzyme(ACE)Inhibitory Activity of Fermented Soybean Milk by Lactobacillus casei Strains[J].Current Microbiology,2016,73(2):214-219

[18]馮穎杰.米曲霉蛋白酶的酶學性質(zhì)及其應(yīng)用研究[D].無錫:江南大學,2015

[19]李浪,楊旭,薛永亮.現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵技術(shù)工藝、設(shè)備及應(yīng)用研究進展[J].河南工業(yè)大學學報(自然科學版),2011,32(1):89-94