微生物發(fā)酵制備富含共軛亞油酸酸豆乳的研究

高輝，李盟，朱振元，宋巧英，邱靖一，王藝臻，劉婷婷

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid簡(jiǎn)稱CLA）是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱，是一種具有許多生理活性的天然脂肪酸，是亞油酸（Linoleic acid，18：2 n-6）的幾何異構(gòu)體，其中每個(gè)雙鍵可為順式或反式構(gòu)型。因其在18碳脂肪酸的碳鏈上的不同位置，至少包括了28種異構(gòu)體，最常見的、最具有生理活性的異構(gòu)體是c9，t11-CLA和t10，c12-CLA[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)共軛亞油酸與亞油酸在空間結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及生理功能等方面都具有顯著差異，共軛亞油酸經(jīng)腸粘膜吸收滲入到血脂、細(xì)胞膜及脂肪組織，或者經(jīng)過代謝進(jìn)一步合成一系列活性物質(zhì)而發(fā)揮重要的生理功能[5]。此外，共軛亞油酸可以提高人體的免疫力，降低人體內(nèi)脂肪含量，同時(shí)對(duì)抗癌，抗動(dòng)脈粥樣硬化，預(yù)防糖尿病以及改善骨組織代謝有重要的生理意義[6-8]。更有對(duì)實(shí)驗(yàn)老鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)能減少致癌物引起的皮膚癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和胸腺癌[9-11]。

隨著人類對(duì)保健食品的大量需求，共軛亞油酸的需求量也就逐漸增大。目前關(guān)于CLA的合成方法很多，其中主要包括生物合成法和化學(xué)合成法[12-13]。近年來，也有人研究利用超臨界流體的方法來萃取CLA[14]。化學(xué)合成法多采用堿異構(gòu)法，轉(zhuǎn)化率一般較高，但合成產(chǎn)物異構(gòu)體組成十分復(fù)雜，產(chǎn)物分離純化步驟較多，成本較高[15]。生物合成法是采用特定的酶或微生物催化相應(yīng)的底物得到CLA，其中微生物合成法較為常用，許多微生物能夠通過發(fā)酵形成一種能夠合成CLA的酶[14]。目前常用生產(chǎn)CLA的有乳酸桿菌、丁酸弧菌、瘤胃菌、丙酸桿菌、真桿菌屬等[16-17]。

乳酸桿菌產(chǎn)CLA的能力近年來也已得到相當(dāng)廣泛報(bào)道，基本涵蓋乳酸桿菌各個(gè)種屬。Lin[18]等研究表明，脫脂乳中亞油酸可被嗜酸乳桿菌（Lb.acidophilus）轉(zhuǎn)化為CLA。Kishino等[19]報(bào)道了一批微生物可將亞油酸轉(zhuǎn)化至共軛亞油酸，其中的一株植物乳桿菌（Lb.plantarum）可將高達(dá)85%的亞油酸轉(zhuǎn)化為c9，t11-CLA和t9，t11-CLA，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這株植物乳桿菌AKU1009a甚至可直接利用蓖麻油酸和蓖麻油產(chǎn)CLA。

豆?jié){亞油酸含量高達(dá)51.7%～57%[20]。本試驗(yàn)使用植物乳桿菌發(fā)酵豆?jié){制品，生產(chǎn)出富含共軛亞油酸的功能型固態(tài)酸豆乳。分別從豆?jié){的制備工藝條件優(yōu)化以及植物乳桿菌產(chǎn)共軛亞油酸的最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化，不僅提高了豆?jié){中腸道有益菌的數(shù)量和豆?jié){蛋白質(zhì)含量，也最大程度上完善了共軛亞油酸的生產(chǎn)。因此，本試驗(yàn)對(duì)促進(jìn)富含共軛亞油酸固態(tài)發(fā)酵豆乳制品的開發(fā)具有一定的研究?jī)r(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：市售散稱；脫脂奶粉：光明乳業(yè)股份有限公司；蔗糖、瓊脂：均為食品級(jí)市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：由天津科技大學(xué)生物資源與功能食品實(shí)驗(yàn)室提供。

共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)NU-CHEK公司；正己烷、氯仿、無水硫酸鈉、甲醇：天津江天化工技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico&Fresco臺(tái)式離心機(jī)：Heraeus美國(guó)科俊儀器有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；VS-1300L-U超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；UV-29200型紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 乳培養(yǎng)基

脫脂奶粉12g，蒸餾水100mL，115℃滅菌15min。

1.3.2 復(fù)壯培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：1.0%牛肉膏，1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，2.0%葡萄糖，0.1%吐溫-80，0.2%K2HPO4，0.5%乙酸鈉，0.2%檸檬酸二銨，0.02%MgSO4·7H2O 和 0.005%MnSO4·H2O（pH6.5），固體培養(yǎng)基加瓊脂1.8%～2.0%。121℃滅菌30 min。

1.3.3 菌種馴化培養(yǎng)基

逐漸減少脫脂還原乳比例，提高豆?jié){的比例，115℃滅菌15 min，備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 豆?jié){的制備工藝

稱100 g黃豆→加水浸泡→加一定量的水用勻漿機(jī)打制→過濾除去豆渣→加熱煮沸

1.4.2 豆?jié){中粗蛋白含量測(cè)定

對(duì)豆?jié){粗蛋白含量測(cè)定，檢測(cè)方法按照凱氏定氮法[21]。

1.4.3 豆?jié){制備單因素試驗(yàn)

1.4.3.1 浸泡時(shí)間對(duì)豆?jié){蛋白質(zhì)含量的影響

分別設(shè)置 4、8、12、15、18、20、22 h 7 組試驗(yàn)，在水豆比10∶1（mL/g）的情況下制漿，然后測(cè)定豆?jié){蛋白質(zhì)含量。

1.4.3.2 水豆比例對(duì)豆?jié){蛋白質(zhì)含量的影響

分別設(shè)置不同水豆比 10 ∶1、11 ∶1、12 ∶1、13 ∶1、14∶1（mL/g）5組試驗(yàn)，在泡豆時(shí)間15 h條件下制漿，然后測(cè)定豆?jié){蛋白質(zhì)含量。

1.4.3.3 加熱時(shí)間對(duì)豆?jié){蛋白質(zhì)含量的影響

在水豆比10∶1（mL/g）、泡豆時(shí)間15 h的條件下。首先在豆?jié){加熱前取一次樣，然后加熱，當(dāng)豆?jié){沸騰開始計(jì)時(shí)，分別于沸騰后3、5、8、10 min時(shí)取一次樣，然后再測(cè)定豆?jié){蛋白質(zhì)含量。

1.4.4 豆?jié){制備正交試驗(yàn)的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，考察泡豆時(shí)間、水豆比例以及加熱沸騰時(shí)間，分別取不同的水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定豆?jié){制備的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design

1.4.5 菌種活化與馴化

1.4.5.1 菌種活化

在無菌條件下，將冷凍干燥的植物乳桿菌接種到滅菌后的乳培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至乳凝固，以5%的接種量繼續(xù)接種到乳培養(yǎng)基2代～3代，使菌種恢復(fù)活力。

1.4.5.2 菌種馴化與保藏

菌種恢復(fù)活力后，以5%接種量按照以下豆?jié){比例培養(yǎng)基馴化：活化乳培養(yǎng)基→20%豆?jié){培養(yǎng)基→40%豆?jié){培養(yǎng)基→60%豆?jié){培養(yǎng)基→80%豆?jié){培養(yǎng)基→100%豆?jié){培養(yǎng)基，觀察凝乳時(shí)間以及狀態(tài)。每一個(gè)濃度梯度都傳2代～3代，保證菌種在相應(yīng)的濃度穩(wěn)定傳代。在馴化過程中，菌種會(huì)退化，這時(shí)需要用1.3.2復(fù)壯培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)壯。對(duì)馴化后的菌種進(jìn)行低溫斜面保藏。

1.4.6 CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg放入100mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，振蕩使其充分溶解，此時(shí)共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1 mg/mL，然后分 別 吸 取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL放入25 mL的容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成濃度分別為 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以正己烷為參比在233 nm處測(cè)定吸光度，以共軛亞油酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.7 CLA的提取

本文使用氯仿-甲醇法提取共軛亞油酸。首先取1 mL發(fā)酵液于離心管中，在加入2 mL的氯仿：甲醇（2∶1，體積比），振蕩均勻，于 4℃，5 000 r/min離心15 min，收集下層，加入一定量的無水硫酸鈉干燥，然后在30℃真空濃縮，最后用正己烷定容至10 mL，混勻以備檢測(cè)[22]。

1.4.8 CLA含量的測(cè)定

以正己烷為參比，在180 nm～290 nm紫外波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，讀取233 nm處的吸光度。若吸光度不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，則再對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，然后再進(jìn)行測(cè)定。

1.4.9 CLA生產(chǎn)的單因素試驗(yàn)

通過預(yù)試驗(yàn)分析以及為了提高發(fā)酵豆乳產(chǎn)品的品質(zhì)，本文采用蔗糖作為甜味劑，瓊脂作為穩(wěn)定劑、乳化劑，以及發(fā)酵時(shí)間和接種量這4個(gè)因素為主要研究對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)，以期為正交試驗(yàn)準(zhǔn)備。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為80%豆?jié){培養(yǎng)基。

1.4.9.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)CLA產(chǎn)量的影響

從馴化后的豆?jié){培養(yǎng)基以5%接種量接種到新的滅菌的豆?jié){基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，不添加蔗糖和瓊脂，37 ℃下分別恒溫培養(yǎng) 12、18、24、30、36、42、48 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定共軛亞油酸含量。

1.4.9.2 接種量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響

從馴化后的豆?jié){培養(yǎng)基分別以1%、2%、3%、4%、5%接種量接種到新的滅菌的豆?jié){基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，不添加蔗糖和瓊脂，37℃培養(yǎng)24 h至乳凝固后提取發(fā)酵液，用于測(cè)共軛亞油酸含量。

1.4.9.3 蔗糖添加量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響

分別設(shè)置蔗糖添加量為1%、3%、5%、7%、9%5個(gè)水平，每個(gè)水平以5%的量進(jìn)行接種，并且設(shè)置空白對(duì)照組，不添加瓊脂，37℃培養(yǎng)24 h至乳凝固后提取發(fā)酵液，測(cè)定共軛亞油酸含量。

1.4.9.4 瓊脂添加量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響

分別設(shè)置瓊脂添加量為0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%6個(gè)水平，每個(gè)水平以5%的量進(jìn)行接種，并且設(shè)置空白對(duì)照組，不添加蔗糖，37℃培養(yǎng)24 h至乳凝固后，觀察其凝乳的穩(wěn)定狀態(tài)并提取發(fā)酵液，測(cè)定共軛亞油酸含量。

1.4.10 培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，考察發(fā)酵時(shí)間、接種量、蔗糖添加量以及瓊脂添加量，分別取不同的水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定菌株產(chǎn)共軛亞油酸的最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 豆?jié){制備條件的優(yōu)化

2.1.1 浸泡時(shí)間的優(yōu)化

不同浸泡時(shí)間豆?jié){蛋白含量見圖1。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experimental design

圖1 不同浸泡時(shí)間豆?jié){蛋白含量Fig.1 Protein content of soymilk with different immersion

從圖1可以看出，隨著浸泡時(shí)間的增加豆?jié){蛋白質(zhì)含量增加，這是由于黃豆經(jīng)過浸泡后，蛋白質(zhì)更容易溶出，但是當(dāng)浸泡時(shí)間超過15 h后，豆?jié){蛋白質(zhì)含量下降，可能是因?yàn)榻輹r(shí)間太長(zhǎng)，黃豆浸泡液中有大量的白色乳液，這可能是蛋白質(zhì)流失到浸泡液中。綜合考慮，本試驗(yàn)采用8、12、15 h為浸泡時(shí)間的3個(gè)水平。

2.1.2 水豆比例條件的優(yōu)化

不同水豆比例下豆?jié){蛋白含量見圖2。

圖2 不同水豆比例下豆?jié){蛋白含量Fig.2 Protein content of soymilk with different weight rations of water and beans

由圖2可知，隨著水豆比例的增加，豆?jié){逐漸被稀釋，豆?jié){中蛋白質(zhì)的濃度也逐漸降低，為了提高豆?jié){的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，經(jīng)綜合考慮選用10∶1、11∶1、12∶1（mL/g）為水豆比例的3個(gè)水平。

2.1.3 加熱時(shí)間條件優(yōu)化

不同加熱時(shí)間下豆?jié){蛋白含量見圖3。

圖3 不同加熱時(shí)間下豆?jié){蛋白含量Fig.3 Protein content of soymilk with different heating time

由圖3可知，隨著加熱時(shí)間的增加，豆?jié){溶液逐漸被濃縮，豆?jié){中蛋白質(zhì)含量逐漸升高，但是當(dāng)加熱時(shí)間超過8 min時(shí)，豆?jié){會(huì)出現(xiàn)糊味并且蛋白質(zhì)在豆?jié){表面凝聚成一層厚厚的膜，使豆?jié){口感和顏色都欠佳。因此本試驗(yàn)選用3、5、8 min為加熱時(shí)間的3個(gè)水平。

2.1.4 豆?jié){制備條件的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3極差分析可知，各因素的主次順序?yàn)锽（水豆比例）＞C（加熱時(shí)間）＞A（泡豆時(shí)間）。通過單因素和正交試驗(yàn)，確定豆?jié){制備的最佳條件為A3B1C3，即泡豆時(shí)間15 h，水豆比例10∶1（mL/g），加熱時(shí)間 8 min。豆?jié){蛋白質(zhì)含量在此條件下為3.96%。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3The results of orthogonal experiment of L9（34）

2.2 菌種的馴化以及基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

通過對(duì)植物乳桿菌在不同豆?jié){濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)接，通過觀察凝乳時(shí)間以及生長(zhǎng)特性，研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可以在100%豆?jié){培養(yǎng)基中較好的生長(zhǎng)，而且具有穩(wěn)定傳代的性狀。為了提高豆?jié){的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，本試驗(yàn)選用80%的豆?jié){培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并且對(duì)該濃度下馴化的菌種進(jìn)行低溫斜面保藏，每次使用前都需要進(jìn)行活化2次～3次后使用。

2.3 CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of CLA

由圖4可得到共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸為Y=0.0739x+0.0314，其中Y代表233nm處的吸光度，x代表待測(cè)樣品共軛亞油酸濃度，R2=0.997 4說明回歸擬合效果較好。

2.4 菌株產(chǎn)共軛亞油酸條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵時(shí)間條件的優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間對(duì)CLA產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)CLA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on CLA production

由圖5可得CLA產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的變化，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的增加植物乳桿菌不斷生長(zhǎng)繁殖，使亞油酸異構(gòu)酶含量也增加，但是當(dāng)時(shí)間超過36 h時(shí)，CLA產(chǎn)量逐漸降低，可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)乳酸菌產(chǎn)酸量增多導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)pH值下降從而抑制了亞油酸異構(gòu)酶活性。因此選用發(fā)酵時(shí)間24、30、36 h 3 個(gè)水平。

2.4.2 接種量條件的優(yōu)化

接種量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6 接種量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on CLA production

由圖6可得，隨著接種量的增加，培養(yǎng)基內(nèi)乳酸菌繁殖更加旺盛，CLA產(chǎn)量也隨之增加。但是當(dāng)接種量超過3%時(shí)，可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限使菌種競(jìng)爭(zhēng)性抑制加強(qiáng)導(dǎo)致菌種衰退甚至死亡，使CLA產(chǎn)量下降。本試驗(yàn)選用2%、3%、4%為接種量3個(gè)水平。

2.4.3 蔗糖添加量條件的優(yōu)化

蔗糖添加量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響見圖7。

圖7 蔗糖添加量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of sucrose content on CLA production

由圖7可得，隨著蔗糖添加量的增加，為植物乳桿菌生長(zhǎng)提供了更多的碳源，CLA產(chǎn)量也逐漸增加。當(dāng)添加量超過7%時(shí)，CLA產(chǎn)量逐漸降低，原因可能是高糖溶液使乳酸菌細(xì)胞處于高滲溶液從某種程度上抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，且有文獻(xiàn)表明一定濃度的蔗糖溶液對(duì)CLA的生成有一定的抑制作用[23-26]。綜合考慮，本試驗(yàn)選用6%、7%、8%為蔗糖添加量3個(gè)水平。

2.4.4 瓊脂添加量條件的優(yōu)化

瓊脂添加量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響見圖8。

由圖8可得，瓊脂添加量對(duì)CLA產(chǎn)量無較明顯的影響，但是當(dāng)瓊脂添加量超過0.8%時(shí)，CLA產(chǎn)量顯著下降而且在培養(yǎng)基的溶解性以及凝乳效果都較差，可能是由于瓊脂量較多在某種程度上為植物乳桿菌的生長(zhǎng)提供了阻力。因此，本試驗(yàn)選用0.6%、0.7%、0.8%為瓊脂添加量的3個(gè)水平。

圖8 瓊脂添加量對(duì)CLA產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of agar content on CLA production

2.4.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4極差分析可知，各因素的主次順序?yàn)锽（接種量）＞A（發(fā)酵時(shí)間）＞C（蔗糖添加量）＞D（瓊脂添加量）。通過單因素和正交試驗(yàn)K值推斷出最優(yōu)結(jié)果為A3B3C1D3，然后再與編號(hào)6條件下所制得酸豆乳的共軛亞油酸產(chǎn)量進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在A3B3C1D3條件下測(cè)得共軛亞油酸含量為29.68 μg/mL，此含量低于編號(hào)6條件下的共軛亞油酸產(chǎn)量，因此確定培養(yǎng)條件的最佳水平為A2B3C1D2，即蔗糖添加量6%、瓊脂添加量0.7%、接種量4%、培養(yǎng)時(shí)間30 h，其共軛亞油酸產(chǎn)量為29.83 μg/mL。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4The results of orthogonal experiment of L9（34）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先從單因素和正交試驗(yàn)確定了豆?jié){制備的最佳工藝流程為：泡豆15h、水豆比例10∶1（mL/g）、加熱沸騰時(shí)間8 min，在此條件下，豆?jié){中蛋白質(zhì)含量為3.96%。由于植物乳桿菌不能直接在豆?jié){培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此本文對(duì)乳酸菌在不同比例的豆?jié){培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，最終選擇80%豆?jié){培養(yǎng)基為后續(xù)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。通過單因素和正交試驗(yàn)確定菌株產(chǎn)CLA的最佳發(fā)酵條件為：蔗糖添加量6%、瓊脂添加量0.7%、接種量4%、培養(yǎng)時(shí)間30 h，在此條件下，最終得到的CLA產(chǎn)量為29.83 μg/mL。

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