番木瓜籽中硫代葡萄糖苷的超聲輔助降解研究

于磊，李文釗，姜化彬，韓紅超，阮美娟

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

番木瓜籽是番木瓜加工過程中的廢料，目前沒有得到充分利用，番木瓜籽占番木瓜重量的7%，將番木瓜籽綜合開發(fā)利用，對提高番木瓜產(chǎn)業(yè)的附加值具有重要意義[1]。目前對番木瓜籽已開展了較多的研究，主要集中在以下幾個方面：番木瓜籽營養(yǎng)成分分析、番木瓜籽油的提取及成分分析和功能評價、番木瓜籽中活性成分的相關(guān)研究、番木瓜籽中異硫氰酸酯的研究[2-4]等。異硫氰酸酯是一類具有-N=C=S基團的化合物，是硫代葡萄糖苷的酶解產(chǎn)物[5]，在自然界中主要以硫代葡萄糖苷的形式廣泛存在于十字花科[6]、番木瓜科、柏樂樹科、白花菜科、旱金蓮科、多籽果科等雙子葉植物中[7]。異硫氰酸酯是一種具有特殊風味的物質(zhì)，其抗癌活性已經(jīng)得到了確認，對于其抑菌活性、提高細胞的抗氧化能力的研究還正在進行[8]。硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，簡稱GS）是一類廣泛存在于植物界的次生代謝產(chǎn)物，其降解產(chǎn)物具有多種活躍的化學和生物活性[9-10]。GS種類繁多，根據(jù)其側(cè)鏈R基團來源不同可以分為脂肪族、芳香族和吲哚族3大類[6，11]。GS降解過程受多種因素影響而難以控制：不同種類的GS在硫苷酶作用下產(chǎn)生異硫氰酸酯類、腈類、硫氰酸酯類、環(huán)腈類、惡唑烷酮類化合物等，在較高溫度下能發(fā)生自降解，在強酸、強堿以及某些化學物質(zhì)的作用下也不穩(wěn)定，也能在微生物作用下有效降解[9，12]。硫代葡萄糖苷的降解方式共包含4種方式，酶降解、熱降解、化學降解、微生物降解[11，13]。本文在酶降解基礎(chǔ)上，對番木瓜籽中的硫代葡萄糖苷進行超聲輔助降解，優(yōu)化超聲波輔助降解工藝，使異硫氰酸芐酯（Benzylisothiocyanate，簡稱BITC）得率達到最大，為提高GS的轉(zhuǎn)化率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要原輔料

番木瓜籽：海南斯坦德生物科技有限公司；異硫氰酸芐酯（98%）：西格馬奧格里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

752E紫外可見分光光度計：天津市普瑞斯儀器有限公司；KA2200DE超聲波清洗機：昆山超聲儀器有限公司；VARIAN4000MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國瓦里安技術(shù)有限公司；FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技公司

1.2 方法

1.2.1 硫代葡萄糖苷的檢測方法

硫代葡萄糖苷的檢測采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）比色法，制作葡萄糖標準曲線，并對硫代葡萄糖苷進行測定[14]。

1.2.1.1 樣品的降解

樣品超聲輔助降解：準確稱取番木瓜籽粉末樣品0.500 g兩份，分別置于兩支25 mL刻度試管中。在一支試管中加入35℃～38℃蒸餾水15 mL，置37℃水浴中恒溫酶解48 min，使硫代葡萄糖苷在芥子酶作用下完全水解，完成酶解后加熱至沸并保持10 min。在一支試管中加沸水15 mL，立即加熱至沸并保持10 min。隨后進行超聲輔助降解。

1.2.1.2 硫代葡萄糖苷的檢測

在兩支試管中分別加入2 mL三氯乙酸，以沉淀其中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，靜置后在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心除去殘渣（殘渣體積約2 mL），將上清液移至25 mL刻度試管，加1.5 mL濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，最后加蒸餾水定容至25 mL，濾紙過濾，取濾液各0.5 mL，按葡萄糖標準曲線繪制方法，分別測定其吸光度。

1.2.1.3 硫代葡萄糖苷含量的計算

硫代葡萄糖苷含量按公式（1）計：

式中：C1為滅酶管葡萄糖量，mg；C2為酶解管葡萄糖量，mg；m為樣品質(zhì)量，mg；2.167為硫代葡萄糖轉(zhuǎn)化為硫代葡萄糖苷的系數(shù)（以芐基硫代葡萄糖苷計算）。

1.2.2 異硫氰酸芐酯的檢測方法

在NY/T 1596-2008《油菜餅粕中異硫氰酸酯的測定（硫脲比色法）》的基礎(chǔ)上進行改進，利用內(nèi)源酶進行酶解代替在樣品前處理中加芥子酶[15]。

1.2.2.1 樣品的處理

1）樣品熱降解處理：將番木瓜籽用萬能粉碎機粉碎，過100目標準篩，準確稱取0.200 0 g番木瓜籽粉末放入圓底燒瓶中，加入5.0 mL水混合，接冷凝器，于集熱式恒溫磁力攪拌器中油欲，在適當溫度下恒溫油浴1 h，熱降解完成后，轉(zhuǎn)移至具塞試管中備用。

2）將番木瓜籽用萬能粉碎機粉碎，過100篩，準確稱取0.200 0 g番木瓜籽粉末放入具塞試管中，加入2.0 mL pH值為7.0的緩沖溶液充分混合并在35℃下恒溫水浴2 h，水浴酶解完成后，樣品備用。

往具塞試管中加2.5 mL二氯甲烷，用旋渦混合器混合均勻，在室溫下震蕩0.5 h，4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取6.0 mL體積分數(shù)為80%的氨乙醇于具塞試管，用微量進樣器取離心管下層有機相50 μL，加入到裝有80%氨乙醇具塞試管中，蓋上塞。漩渦混合均勻，將具塞試管放入水浴鍋，50℃下加熱0.5 h后取出，冷卻至室溫，用紫外分光光度計，10 mm石英比色皿測定光密度值，測定波長分別為 235、245、255 nm。同時測定試樣空白溶液。

1.2.2.2 異硫氰酸芐酯含量的計算

試樣中異硫氰酸芐酯的含量（ω）以每克樣品中異硫氰酸芐酯的毫克數(shù)（mg/g）表示，按公式（2）計算：

式中：O.D235為試樣235 nm處的光密度值；O.D245為試樣245 nm處的光密度值；O.D255為試樣255 nm處的光密度值；28.55為異硫氰酸芐酯的換算系數(shù)。

1.2.3 番木瓜籽中硫苷超聲輔助降解產(chǎn)物研究

1.2.3.1 番木瓜籽硫苷超聲輔助降解產(chǎn)物的制備方法

番木瓜籽用萬能粉碎機粉碎，過100目標準篩，準確稱取0.2 g木瓜籽粉末于10 mL刻度試管中，加入配制好pH值為7.0的緩沖液4 mL，旋渦混合器充分混勻，于35℃酶解反應(yīng)48 min，隨后進行超聲輔助降解。

降解樣品加入5 mL正己烷，用旋渦混合器充分混合均勻，將混合均勻的樣品移至15 mL離心管中，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將下層有機相移至具塞試管中，加入過量無水硫酸鈉除水，并置于冰箱冷凍過夜，將上清液取出作為待測樣品。

1.2.3.2 GC-MS分析條件

色譜條件：在此基礎(chǔ)上進行改進，DB-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；升溫程序：100℃保持3 min，以10℃/min升至310℃，保持5 min；載氣為He，流速1.4 mL/min；進樣口溫度250℃，分流比 10 ∶1，進樣量 1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度200℃；離子源溫度200℃；質(zhì)量掃描范圍 m/z 40～600。

1.2.3.3 紅外光譜儀分析條件

紅外光譜儀條件：背景掃描次數(shù)，32；樣品掃描次數(shù)，32；采樣增益，4.0；分辨率，4.000；光闌，100.00；分束器，KBr；動鏡速度，0.474 7；檢測器，DTGS ART；光源，紅外光源IR。

1.2.4 超聲波輔助降解對硫代葡萄糖苷降解的影響

探究超聲波對硫代葡萄糖苷降解的影響，在內(nèi)源酶降解基礎(chǔ)上進行超聲輔助降解。酶解條件為：緩沖液 pH4.8，料液比 1∶20（g/mL），酶解時間 48min，酶解溫度27℃。

1.2.4.1 超聲時間對硫代葡萄糖苷可控降解的影響

探究超聲時間對硫代葡萄糖苷降解的影響，超聲功率60 W，水溫30℃，超聲時間分別為0、5、10、15、20、25、30 min。分別測定 GS 降解率、BITC 得率。

1.2.4.2 超聲溫度對硫代葡萄糖苷可控降解的影響

探究超聲溫度對硫代葡萄糖苷降解的影響，超聲功率60 W，超聲時間25 min，超聲溫度分別為20、35、50、65、80 ℃。分別測定 GS 降解率、BITC得率。

1.2.4.3 超聲功率對硫代葡萄糖苷可控降解的影響

探究超聲功率對硫代葡萄糖苷降解的影響，超聲溫度35℃，超聲時間25 min，超聲溫度功率為40、60、80、100 W。分別測定 GS降解率、BITC 得率。

1.2.4.4 超聲波輔助番木瓜籽中硫代葡萄糖苷降解的優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行影響面優(yōu)化，根據(jù)Box-Behnken模型的試驗設(shè)計原理[16]，用Design-Expert軟件安排試驗組合。分別測定異硫強酸芐酯得率及硫代葡萄糖苷降解率。

1.2.4.5 超聲輔助硫代葡萄糖苷降解產(chǎn)物分析

利用GC-MS，分別對最優(yōu)條件下（異硫強酸芐酯得率最高、硫代葡萄糖苷降解率最高）的降解產(chǎn)物進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫代葡萄糖苷含量檢測

葡萄糖標準曲線的制作：經(jīng)試驗獲得的葡萄糖濃度與吸光度關(guān)系，葡萄糖標準曲線見圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

吸光度Y與葡萄糖濃度X（mg/mL）的關(guān)系為：

此標準曲線可用于溶液中葡萄糖含量的測定，進而計算出溶液中硫代葡萄糖苷的含量。

2.2 超聲波輔助降解對硫代葡萄糖苷降解的影響

原料粒徑100目，按照酶解條件料液比1∶20（g/mL），緩沖液pH=4.8，酶解時間48 min進行酶解，隨后進行超聲輔助降解，因素為時間、功率、溫度。以GS降解率、BITC得率為指標分別進行單因素試驗，并進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.1 超聲時間對硫代葡萄糖苷降解的影響

探究超聲時間對硫代葡萄糖苷降解的影響，超聲功率60 W，超聲溫度30℃，超聲時間分別為：0、5、10、15、20、25、30 min。原料粒徑 80 目，酶解條件：27 ℃、料液比 1 ∶20（g/mL），pH=4.8，酶解 48 min 輔助條件：超聲功率60 W，溫度30℃。分別測定GS降解率、BITC得率。結(jié)果如圖2。

圖2 超聲時間對GS降解的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on degradation of GS

由圖2可知，隨著超聲時間延長，GS降解率呈增大趨勢，當超聲時間達到25 min時，GS降解率最大，為74.68%±1.24%，當輔助時間繼續(xù)延長時，GS降解率不再增加。隨著超聲時間延長，BITC得率逐漸增大，在超聲時間為15 min時，BITC得率最高，達到（0.531±0.008）%，當輔助時間繼續(xù)延長時，BITC得率不再增加。

2.2.2 超聲溫度對硫代葡萄糖苷降解的影響

探究超聲溫度對硫代葡萄糖苷降解的影響，超聲功率60 W，測定GS降解率時超聲時間為25 min（測定BITC得率時超聲時間15 min），超聲溫度分別為：20、35、50、65、80℃。分別測定 GS降解率、BITC得率。結(jié)果如圖3。

圖3 超聲溫度對GS降解的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on degradation of GS

由圖3可知，隨著超聲溫度升高，GS降解率呈增大趨勢，當超聲溫度達到35℃時，GS降解率最大，為（77.25±1.12）%，當超聲溫度繼續(xù)增大時，GS降解率不再增加。隨著超聲溫度升高，BITC得率逐漸增大，在超聲溫度為35℃時，BITC得率最高，達到（0.554±0.004）%，當輔助溫度繼續(xù)升高時，BITC得率不再增加。

2.2.3 超聲功率對硫代葡萄糖苷降解的影響

探究超聲功率對硫代葡萄糖苷降解的影響，超聲溫度35℃，測定GS降解率時超聲時間為25 min（測定BITC得率超聲時間15 min），超聲功率為40、60、80、100 W。分別測定GS降解率、BITC得率。結(jié)果如圖4。

圖4 超聲功率對GS降解的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on degradation of GS

由圖4可知，隨著超聲溫度升高，GS降解率呈增大趨勢，當超聲功率達到60 W時，GS降解率最大，為77.187%±1.3%，當超聲溫度繼續(xù)增大時，GS降解率不再增加。隨著超聲溫度升高，BITC得率逐漸增大，在超聲功率為60 W時，BITC得率最高，達到（0.554±0.005）%，當輔助功率繼續(xù)增大時，BITC得率不再增加。

2.2.4 超聲波輔助對番木瓜籽中BITC得率優(yōu)化試驗

結(jié)合單因素試驗結(jié)果以BITC得率為優(yōu)化指標，設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗，超聲波輔助BITC得率響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計見表1。

應(yīng)用Design-Expert軟件對上述試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，可以得到該模型的二階擬合方程：

表1 超聲波輔助GS降解響B(tài)ITC得率響應(yīng)面優(yōu)化試驗Table 1 Response surface optimization experiment of ultrasonic assisted GS degradation BITC yield

該模型的方差分析結(jié)果見表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計二階回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the second-order regression model

從表2可以看出，該回歸模型P值＜0.000 1，說明了該方程模型極顯著，模型失擬項P值＞0.05，說明失擬不顯著，可以利用該模型預(yù)測異硫氰酸芐酯的最高得率；從分差分析結(jié)果來看，超聲時間，超聲功率對輔助酶解得率影響極顯著，超聲溫度對輔助酶解得率影響顯著；超聲時間與超聲功率的交互相應(yīng)對酶解得率有顯著影響，超聲時間與超聲溫度，超聲功率與超聲溫度的交互相應(yīng)對酶解得率有極顯著影響，說明超聲時間（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）3個因素對酶解得率的影響不只是簡單的線性關(guān)系，交互項、二次項也有一定的影響。

應(yīng)用Design-Expert軟件對上述試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，可以得到該模型的響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖5。

從圖5響應(yīng)面及等高線圖來看，超聲時間、超聲功率、超聲溫度之間具有一定的交互效應(yīng)。通過Design Expert軟件對試驗?zāi)Ｐ瓦M行優(yōu)化，以異硫氰酸芐酯得率最高為優(yōu)化目標，得到的最優(yōu)超聲時間16.17 min、超聲功率56.82 W、超聲溫度37.72℃，預(yù)期BITC得率0.56%。實際操作過程中選擇超聲時間16.17 min、超聲功率60 W、超聲溫度38℃，此時異硫氰酸芐酯的得率為0.558%，硫代葡萄糖苷的降解率為（63.62±1.17）%。

圖5 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map

2.2.5 降解BITC提取分離及鑒定

2.2.5.1 酶解超聲輔助降解BITC提取分離

番木瓜籽粉碎過100目篩，按照酶解條件（料液比 1 ∶20 g/mL，緩沖液 pH=4.8，酶解時間 48 min）進行酶解，在超聲時間16.17 min、超聲功率60 W、超聲溫度38℃條件下進行輔助降解。隨后將降解產(chǎn)物進行同時蒸餾萃取，萃取目標產(chǎn)物BITC。收集粗提物約1 g進行硅膠柱層析，獲得BITC純品。隨后進行GC-MS分析，見圖6。

圖6 番木瓜籽提取物的GC-MS分析譜圖Fig.6 GC-MS analysis spectra of papaya seed extract

如表3，初步判定出硫代葡萄糖苷可能的酶解產(chǎn)物，分別為苯甲醛（RT3.41min）、氯化芐（RT3.615min）、異氰酸芐酯（RT5.085min）、硫氰酸芐酯（RT8.533 min）、異硫氰酸芐酯（RT8.834 min），通過分析可以發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物中有芐基，由此推測番木瓜籽中含有芐基硫代葡萄糖苷；由于在氣質(zhì)分析結(jié)果中并沒有發(fā)現(xiàn)其他類別的異硫氰酸酯，所以可以認為番木瓜籽中只有芐基硫代葡萄糖苷這一種硫苷，這與文獻報道的結(jié)果相一致。另外純化后番木瓜籽提取物中異硫氰酸芐酯純度達到98.81%，純度很高。

表3 番木瓜籽提取物GC-MS結(jié)果分析Table 3 Analysis of papaya seed extract GC-MS

2.2.5.2 番木瓜籽提取物的鑒定

經(jīng)過GC-MS結(jié)果可以看出，番木瓜籽酶解產(chǎn)物主要為異硫氰酸芐酯，其對應(yīng)的主要前提物質(zhì)為芐基硫苷，為了進一步確定提取物為異硫氰酸芐酯，通過紅外光譜的方法對純化后的提取物進行鑒定。

用毛細管吸取少量的異硫氰酸芐酯提取物和異硫氰酸芐酯標品分別涂抹樣品去，進行400 cm-1～4 000 cm-1的紅外光譜掃描。

紅外條件：背景掃描次數(shù)，32；樣品掃描次數(shù)，32；采樣增益，4.0；分辨率，4.000；光闌，100.00；分束器，KBr；動鏡速度，0.474 7；檢測器，DTGS ART；光源，紅外光源IR。

圖7 番木瓜籽異硫氰酸芐酯純化物和異硫氰酸芐酯標品紅外光譜Fig.7 Infrared spectroscopy of purified benzyl isothiocyanate from papaya seed and benzyl isothiocyanate standard substance

由圖7，3 032 cm-1為苯環(huán)上=C-H的伸縮振動（ν=C-H），2 924 cm-1為亞甲基的不對稱伸縮振動（ν-CH2），2 860 cm-1為亞甲基的對稱伸縮振動（ν-CH2），2 175、2 093 cm-1為-N=C=S 的特征吸收峰，1 604、1 496、1 454、1 439 cm-1為苯環(huán)骨架振動吸收帶（ν骨架），732、699 cm-1芳氫的面外彎曲振動（ν=C-H），454 cm-1環(huán)上C=C面外彎曲振動。經(jīng)過對比，番木瓜籽異硫氰酸芐酯純化物和異硫氰酸芐酯標品的紅外光譜一致。

3 結(jié)論

超聲波輔助番木瓜籽中硫代葡萄糖苷的降解試驗中，在內(nèi)源酶水解硫代葡萄糖苷的基礎(chǔ)上進行超聲波輔助。在單因素基礎(chǔ)上，對超聲時間、超聲功率、超聲溫度3個因素進行優(yōu)化。以異硫氰酸芐酯得率最高為優(yōu)化目標，發(fā)現(xiàn)超聲時間、超聲功率、超聲溫度之間具有一定的交互效應(yīng)。得到的最優(yōu)超聲時間16.17 min、超聲功率60 W、超聲溫度38℃，異硫氰酸芐酯的得率為0.558%，此時硫代葡萄糖苷的酶解率為63.62%。純化后經(jīng)氣相色譜及紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)純化物為異硫氰酸芐酯，且純度較高，達到98.81%。

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