超聲微波協(xié)同萃取柚皮總黃酮及其抗氧化性研究

李志銳，樂粉鵬，王娟，韓淑琴，*

（1.中山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東中山528404；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100176；3.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽550025）

我國是柚子的生產(chǎn)大國，柚子種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，但由于受多重因素的限制，柚果深加工的程度很低，國人多以鮮食為主。因此，占柚子總量約為45%的柚皮，除極少部分直接作為中藥材或作為提取果膠和香精油的原料外，90%以上以廢棄物的形式直接排入環(huán)境。柚子皮中含有可觀的黃酮類物質(zhì)，它在堿性條件下，經(jīng)氫化處理，可得到高甜度、低能量的柚皮甙二氫查爾酮，其甜度是蔗糖的1000倍。柚皮甙在柚皮中的含量約3%～5%[1-9]，具有抗過敏、降血壓、消炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、保肝和降血脂等活性，在食品和醫(yī)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用。在食品工業(yè)上可作抗氧化劑、色素和甜味劑等，在醫(yī)學(xué)上對治療冠心病、腦血栓和消除自由基等方面有顯著效果。

文章著重對柚皮提取總黃酮的工藝進(jìn)行了研究，筆者在全面考慮已有提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)及現(xiàn)有條件的基礎(chǔ)上，以黃酮得率為指標(biāo)，選用超聲微波協(xié)同萃取法（Ultrasonic microwave co extraction，UMAE），通過單因素試驗和正交試驗，確定較優(yōu)的提取工藝參數(shù)，并采用DPPH自由基對提取的總黃酮粗品作了抗氧化性的測定，以期為提高柚子綜合利用率，提升柚子的經(jīng)濟(jì)效益提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

柚子：采自廣東?。昏肿颖砥し勰褐猩铰殬I(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)分析實驗室自制。

1.1.2 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇（AR，批號20100821）：廣東光華化學(xué)廠有限公司；DPPH：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 主要儀器

T6新銳可見光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀：新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；JJ500電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；雙圈牌定性濾紙：杭州沃華濾紙有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于25 mL比色管中，用30%乙醇稀釋至1.0 mL，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后，再加入1 mol/L氫氧化鈉4 mL，加水至10 mL的刻度，搖勻，放置 15min 后，在 510nm 波長測定[1，3-19]。

1.2.2 樣品的測定

取樣品液2 mL置于25 mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后，再加入1 mol/L氫氧化鈉4 mL，加水至10 mL的刻度，搖勻，放置15 min后，在510 nm波長測定。

1.2.3 單因素試驗

以黃酮提得率為評價指標(biāo)，分別考察不同提取時間（10、15、20、25、30、35 s）、不同料液比（g/mL）（1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40）、不同提取功率（70、75、80、85、90、95 W）、不同乙醇濃度（60%、65%、70%、75%、80%、85%）下對柚皮黃酮提取得率的影響。

1.2.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以黃酮提得率為考察指標(biāo)，以提取時間、料液比、提取功率、乙醇濃度為考察因素，各取3個水平，進(jìn)行正交試驗，以確定提取柚子皮中黃酮的最佳工藝條件，正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平設(shè)計Table 1Factor and level of L9（34）orthogonal test

1.2.5 黃酮得率的測定

總黃酮得率/%＝c×v×n/m×100

式中：c為有標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的總黃酮濃度，（mg/mL）；v為待測液的體積，mL；n為浸提液稀釋的倍數(shù)；m為每份柚子表皮粉末的質(zhì)量，mg。

黃酮得率/%=（黃酮提取量/柚子皮質(zhì)量）×100

1.2.6 柚子表皮黃酮類化合物的抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH溶液的配制

準(zhǔn)確稱取19.72mgDPPH試劑，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶中，DPPH溶液濃度為0.5mmoL/mL，避光保存（0℃～4℃）。

1.2.6.2 提取物清除DPPH自由基活性的測定

每組試驗中的柚子表皮提取液的濃度為相同值。

1）取柚子表皮提取液2mL及濃度為0.5mmol/mL的DPPH溶液2 mL先后加入同一具塞試管中，搖勻，在黑暗中37℃放置20 min，以65%乙醇為空白在514 nm測定其吸光度Ai。

2）取2 mL 0.5 mmol/mL的DPPH溶液與2 mL 65%乙醇混合，搖勻，在黑暗中37%放置20 min，以65%乙醇為空白在514 nm測定其吸光度A0。

3）取2 mL柚子表皮提取液與2 mL 65%乙醇混合，搖勻，在黑暗中37℃放置20 min，以65%乙醇為空白在514 nm測定其吸光度Aj。

根據(jù)下列公式計算柚子表皮提取液對DPPH自由基的抑制率，即

抑制率/%=[1－（Ai－Aj）/A0]×100

式中：Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度；A0為末加抗氧化劑時DPPH與乙醇混合溶液的吸光度；Aj為柚子表皮提取液在測定波長的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

由圖1可得，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=11.529x+0.001 2。相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，直觀的說明了其線性關(guān)系很好，相關(guān)性很強(qiáng)。在取5個點(diǎn)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)中，相鄰兩位數(shù)值的差值較為穩(wěn)定，說明其試驗測得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度很高，可取性穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作誤差很小，同時也再次說明其可為之后的代入吸光值求取出的濃度值準(zhǔn)確度會很高。

2.2 單因素試驗

以柚皮黃酮提得率為評價指標(biāo)，分別考察不同提取時間、不同料液比、不同提取功率、不同乙醇濃度下對柚皮黃酮提得率的影響，結(jié)果見圖2～圖5。

由圖2～圖5可知，在UMAE萃取柚皮中黃酮的最佳工藝條件為：提取時間為25 s，料液比為1∶25（g/mL），萃取功率為85 W，乙醇濃度為70%。在上述條件下，黃酮提得率可以達(dá)到0.27%。

2.3 正交試驗

以柚皮黃酮提得率為評價指標(biāo)，選定四因素三水平進(jìn)行正交試驗，因素水平見表1，正交結(jié)果見表2。

圖2 提取時間對柚皮總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids from Pomelo Peel

圖3 料液比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of feed liquid ratio on the yield of total flavonoids

圖4 萃取功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction power on the yield of total flavonoids

圖5 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

表2 柚子皮提取黃酮正交試驗與結(jié)果Table 2 Orthogonal test and results of the extraction of flavonoids from the peel of grapefruit

經(jīng)minitab15.0軟件分析結(jié)果表明，以總黃酮得率為指標(biāo)，乙醇濃度因素的極差最大，表明乙醇濃度對柚皮總黃酮的影響最大，各因素對總黃酮得率的影響程度依次為：乙醇濃度＞料液比＞提取時間＞提取功率，由此分析，總黃酮提取條件的最佳組合為A3B3C2D1，即在提取時間為30 s、料液比為1∶30（g/mL）、提取功率為85 W、乙醇濃度為65%時，總黃酮得率達(dá)到最大值。在上述條件下，做平行試驗柚皮黃酮提得率平均可達(dá)到0.34%。

2.4 柚皮總黃酮的抗氧化活性的測定

不同黃酮濃度對DPPH自由基的抑制作用見圖6。

圖6 不同黃酮濃度對DPPH自由基的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of different flavonoid concentrations on DPPH·

由圖6可以看出，柚子表皮黃酮類化合物濃度較小時，隨著濃度的增加，對DPPH自由基抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)柚子表皮黃酮類化合物濃度達(dá)到0.000 387（mg/mL）時，對DPPH自由基抑制作用達(dá)到最佳，抑制率可達(dá)到97.55%，之后，隨著柚子表皮黃酮類化合物濃度繼續(xù)增加，對DPPH自由基抑制作用逐步降低。

3 結(jié)果與討論

超聲-微波協(xié)同萃取法提取，是利用超聲波振動空化作用以及微波的高能作用，從而加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶劑相，可在低溫常壓條件下進(jìn)行提取，可有效保持柚子表皮黃酮類化合物生物活性，且整個提取過程與傳統(tǒng)提取方法相比時間短，能耗低，綠色環(huán)保，無環(huán)境污染。

1）通過單因素試驗，選擇對提取率影響較大的因素及適當(dāng)?shù)乃阶稣辉囼?，確定超聲微波協(xié)同萃取柚皮中總黃酮的最佳工藝條件為：提取時間為30 s、料液比為 1 ∶30（g/mL）、提取功率為 85 W、乙醇濃度為65%。在此條件下，經(jīng)多次平行試驗得出黃酮提得率平均值可達(dá)到0.34%。

2）對提取的總黃酮提取液進(jìn)行不同梯度的稀釋，測定不同黃酮濃度對DPPH自由基的抑制率。柚子表皮黃酮類化合物濃度較小時，隨著濃度的增加，對DPPH自由基抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)柚子表皮黃酮類化合物濃度達(dá)到0.000 387（mg/mL）時，對DPPH自由基抑制作用達(dá)到最佳，抑制率可達(dá)到97.55%，之后，隨著柚子表皮黃酮類化合物濃度繼續(xù)增加，對DPPH自由基抑制作用逐步降低。

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