柑橘皮中總黃酮提取工藝及降血糖活性的試驗研究

（湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術學院，湖南湘潭411102）

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病。長期血糖增高，大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經、眼睛、足等，據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，糖尿病并發(fā)癥高達100多種，是目前已知并發(fā)癥最多的一種疾病，嚴重影響了患者的身心健康。而化學方法合成的抗糖尿病藥物對人體副作用大，著手從天然產物中研制降血糖藥物，是目前學者熱衷研究的方向之一[1]。在治療糖尿病的天然產物中，黃酮類成分扮演著重要的角色[2]。

柑橘皮作為傳統(tǒng)的中藥，其中的黃酮類物質含量豐富，主要包括黃烷酮、黃酮和多甲氧基黃酮等3類物質[3]，其中以黃烷酮苷為主?，F(xiàn)代藥理研究表明，柑橘黃酮具有抗氧化、抗菌與抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂及增強免疫力等活性[4-8]。近年來對柑橘黃酮的藥理作用研究較多，但對柑橘黃酮類物質的降血糖作用研究較少。本文對柑橘皮中總黃酮的乙醇提取工藝及輔助降血糖作用進行了研究，試驗結果能為柑橘皮的進一步開發(fā)和應用提供依據。

1 試驗材料

1.1 原料

柑橘：購買于湖南蘆溪縣某農貿市場，產地為湖南蘆溪縣。

1.2 試劑

蘆丁對照品（含量為92.8%，中國食品藥品檢定研究院，100080-201407）；四氧嘧啶（北京中生瑞泰科技有限公，型號：1122）；鹽酸二甲雙胍片（深圳市中聯(lián)制藥有限公司）；注射用生理鹽水（天津藥業(yè)焦作有限公司）；乙醇、其余試劑、試藥均為分析純。

1.3 儀器

UV2600雙光束紫外分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；BP211D賽多利斯分析天平（十萬分之一）：德國sartorius賽多利斯；XL-600B多功能粉碎機：永康市小寶電器有限公司；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；ER-52AA旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器；強生穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀及配套試紙。

1.4 試驗動物

雄性SPF級ICR小鼠，清潔級，4周～5周齡，體重20 g～25g，購買于湖南斯萊克景達試驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2017-0002。

2 試驗方法

2.1 原料預處理

將柑橘洗滌后剝皮，再把椪柑皮晾干后烘干至恒重。采用多功能粉碎機粉碎，過60目篩，備用。

2.2 提取工藝條件的確定

根據黃酮易溶于乙醇等性質，該試驗選擇乙醇回流提取法。為了確定柑橘皮中總黃酮的最佳提取工藝，參考了相關文獻資料[9-11]，結合筆者以往的研究經驗，分析得出影響天然藥物中總黃酮提取率的主要因素有乙醇濃度、溶劑用量、提取時間和提取溫度。本試驗采用乙醇濃度（%）、溶劑用量（倍）、提取時間（h）作為考察對象，設計三因素三水平正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝條件。由于天然藥物活性成分的提取次數(shù)一般為2次，所以本次試驗設定提取次數(shù)為2次。每次提取的水浴溫度均設定為85℃[12]。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 The factor and level experiment

2.3 柑橘總黃酮的測定

2.3.1 蘆丁標準曲線的繪制[13]

精密稱定蘆丁對照品5.46 mg置25 mL量瓶中，加一定量無水乙醇溶解，冷卻至室溫，再加無水乙醇至刻度，得0.218 4（mg/mL）的蘆丁對照品溶液。

精密量取對照品溶液 0、2、3、4、5、6、8 mL，分別置25 mL容量瓶中，各加無水乙醇補足至5.0 mL，各加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻、靜置6 min，再4%氫氧化鈉試液10 mL，再加無水乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min。以空白試劑作對照液，用雙光束紫外分光光度計在510 nm的波長處測定吸光度，以對照品質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標得到標準曲線：Y=13.495X-0.0196（R2=0.999 6），式中：Y 為吸光度；X為蘆丁濃度，mg/mL。

2.3.2 柑橘皮中總黃酮提取率計算

按照2.2項下在不同條件下水浴提取得到的提取液，每次提取液趁熱過濾，合并提取液，濃縮、定容至250 mL的容量瓶中。取5 mL提取液，用無水乙醇定容至25 mL容量瓶中，按“2.3.1”方法測定吸光度，平行試驗3次，結果取平均值。查標準曲線，得到總黃酮濃度，即可計算柑橘皮中總黃酮提取率。

總黃酮提取率的計算公式：

式中：C為稀釋液總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；W為樣品重量，g；v為測定的樣品體積，mL；N為稀釋倍數(shù)。

2.4 柑橘皮黃酮對小血糖影響試驗

2.4.1 柑橘皮總黃酮的制備

稱取2.1項下已粉碎的柑橘皮20 g放入圓底燒瓶中，按照2.2項下確定的最佳提取工藝條件提取2次，每次提取液趁熱過濾，合并提取液；經旋轉蒸發(fā)儀，在溫度為65℃下回收乙醇，回提后得到剩余液體約120 mL，再經水浴蒸發(fā)，得浸膏；再將浸膏放于45℃烘箱中干燥，得到粉末狀柑橘皮70%乙醇提取物。

2.4.2 糖尿病小鼠模型的建立

對糖尿病小鼠模型的建立參照文獻[14-15]方法并稍做修改，方法如下：取ICR小鼠100只，雄性，體重為20 g～25 g，適應性飼養(yǎng)3 d，稱重。隨機挑選12只小鼠作為空白對照組，其余小鼠禁食12 h（自由飲水），200 mg/kg劑量下腹腔注射四氧嘧啶生理鹽水溶液（空白對照組注射等體積生理鹽水），建立糖尿病動物模型。72 h后再次禁食（不禁水）12 h，于后尾靜脈采血，血糖儀測定空腹血糖值，血糖值≥11.1（mmol/L）為糖尿病模型小鼠。

2.4.3 柑橘黃酮對糖尿病小鼠模型血糖影響試驗

柑橘黃酮對糖尿病小鼠模型血糖影響試驗參照文獻方法[16-17]并稍做修改，方法如下：選取糖尿病模型小鼠60只，按血糖值隨機分成5組，即二甲雙胍陽性組，模型組、柑橘皮70%乙醇提取物高、中、低3個劑量組。二甲雙胍陽性組，將二甲雙胍片碾碎成粉末狀溶于生理鹽水中，制成10.2 mg/mL質量濃度的溶液，按0.1 mL/g給與灌胃；柑橘皮70%乙醇提取物高、中、低3個劑量組給藥濃度為：稱取2.4.1項下制得的干粉5.0、3.0、1.0 g/kg質量濃度配成生理鹽水溶液，按照0.2（mL/g）給予灌胃；模型組和空白對照組給予等體積的生理鹽水。每天灌胃給藥1次，連續(xù)14 d。分別在灌胃給藥第7天及第14天于尾靜脈取血，用血糖試紙及血糖儀測定其血糖質量濃度的變化。

2.4.4 統(tǒng)計學方法

將試驗數(shù)據輸入電腦軟件，采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有顯著性。

3 結果與分析

3.1 提取工藝技術條件

按照2.3.2項下測定柑橘皮中總黃酮的含量，測定結果見表2。由表2可看出，各因素對柑橘皮中總黃酮得率的影響從大到小依次為乙醇濃度、提取時間、料液比。從各因素水平看，A2、B3、C3組合提取率應最大。但此組合不在正交試驗中，做驗證試驗。試驗結果是：在該組合下，柑橘皮中總黃酮提取率為7.68%。由此優(yōu)化出柑橘皮中總黃酮的最佳提取工藝為70%乙醇，料液比為1∶20（g/mL），回流提取2次，每次2 h，提取溫度設定為85℃。

表2 試驗結果及分析表Table 2 Test results and analysis table

3.2 柑橘總黃酮對四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠空腹血糖的影響

柑橘總黃酮對四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠空腹血糖值的影響見表3。由表3可以看出，柑橘黃酮對空白對照組小鼠的血糖幾乎沒有影響，也就是說對正常小鼠的血糖值幾乎沒有影響；陽性組（二甲雙胍組）200 mg/kg劑量能顯著降低正常小鼠的血糖，陽性組與空白對照組相比較有顯著差異性（P＜0.05）；柑橘皮70%乙醇提取物高、中劑量組相比較無顯著性差異（P＞0.05）；柑橘皮70%乙醇提取物高、中劑量組與陽性藥物相比較無顯著性差異（P＞0.05）；柑橘皮70%乙醇提取物低劑量組與模型組相比較無明顯差異，可能是劑量太低導致效果不是很明顯。試驗結果表明，柑橘皮70%乙醇提取物對四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠模型有一定的輔助降血糖作用，而且有劑量的依賴性。

表3 柑橘總黃酮對糖尿病模型小鼠血糖值的影響Table 3 The effect of total flavonoids form citrus on blood sugar level of Diabetic Mice

4 討論與結論

柑橘類黃酮是一系列具有顯著生物活性的黃酮類化合物所組成的混合物，不但具有獨特的芳香性、良好的水溶性和顯著的藥理作用，而且是一類新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)素。柑橘皮作為傳統(tǒng)的中藥，其輔助降血糖的作用受到了研究者的關注[18-19]。該研究結果也表明，柑橘皮中總黃酮具有降低四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠血糖的作用。目前，大致認為柑橘黃酮降血糖機制主要是與抗氧化性正相關的自由基、脂質過氧化和低密度脂蛋白氧化性改變有關[19-20]，而且試驗研究還停留在在動物試驗階段。關于柑橘黃酮降血糖的濃度與范圍、作用機理和作用靶點還亟待進一步研究。

除了對總黃酮的降血糖作用外，該試驗還研究了柑橘皮中總黃酮的提取工藝，得到其最佳提取工藝條件為：70%乙醇，料液比為 1 ∶20（g/mL），回流提取2次，每次2 h，提取溫度85℃，在此最佳工藝條件下柑橘皮總黃酮提取率7.68%。至于提取次數(shù)和提取溫度對柑橘皮中總黃酮的提取率的影響也有待進一步研究。

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