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    6種熱帶水果多酚組成及其抗氧化活性分析

    2018-03-06 05:20:46李曉樂(lè)楊瑞麗張玉瑩豆榮李武
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:番石榴楊桃龍眼

    李曉樂(lè),楊瑞麗,張玉瑩,豆榮,李武,*

    (1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口570100;2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州510642)

    多酚(polyphenols)是一類(lèi)具有多酚羥基的化合物,其廣泛地分布在水果、蔬菜和谷物中[1],具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病等活性作用[2-4]。天然存在的多酚以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在于食物基質(zhì)中,前者是水或極性溶劑可溶性酚類(lèi)物質(zhì),后者是溶劑不能直接萃取而以酯鍵、糖苷鍵等形式與糖類(lèi)或蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合的酚類(lèi)物質(zhì)。目前對(duì)樣品多酚含量的評(píng)價(jià),主要是采用溶劑直接萃取后進(jìn)行定量分析,此類(lèi)方法可以反映樣品中的游離酚含量,而不能對(duì)其中的結(jié)合酚進(jìn)行分析[1]。最近的研究顯示,多酚對(duì)健康的促進(jìn)作用不僅與其游離酚有關(guān),而且與其結(jié)合酚的含量與組成也密切相關(guān)[5-6]。研究表明,食物中不能被小腸消化吸收的結(jié)合酚,通過(guò)與結(jié)腸微生物的作用釋放發(fā)揮生理活性作用[7-8],結(jié)合態(tài)多酚逐漸成為多酚研究的熱點(diǎn)。

    在日常飲食中,果蔬是人體攝入多酚的主要來(lái)源之一。研究顯示,由于日照和高溫等生長(zhǎng)環(huán)境特點(diǎn),熱帶水果含有相對(duì)較高的多酚類(lèi)物質(zhì)。近年來(lái),研究者對(duì)一些熱帶水果中的酚類(lèi)物質(zhì)、抗氧化活性進(jìn)行了研究。Septembre等[9]比較了法國(guó)6種熱帶水果的抗氧化活性,分析了其多酚提取物對(duì)紅細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的保護(hù)作用。周曉敏等[10]分析了番石榴的酚類(lèi)物質(zhì)組成,發(fā)現(xiàn)番石榴主要含有沒(méi)食子酸、兒茶素、槲皮素等酚類(lèi)成分。但是對(duì)于熱帶水果游離酚和結(jié)合酚中單體酚的比較性分析還十分有限。本文對(duì)我國(guó)6種熱帶特色水果的游離酚、結(jié)合酚含量,單體酚組成以及其抗氧化活性進(jìn)行了分析,旨在為我國(guó)熱帶水果的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    番石榴(Psidium guajava Linn.珍珠,廣東)、楊桃(Averrhoa carambola L.廣東)、芒果(Mangifera indica L.大金煌芒,海南)、荔枝(Litchi chinensis Sonn.桂味,廣東)、檸檬(Citrus limon(L.)Burm.f.廣東)、龍眼(Dimocarpus longan Lour.儲(chǔ)良,廣東):海南省海口市。

    福林酚(Folin-cioaclteu):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH):上海麥克林生化科技有限公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS):山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;Trolox(水溶性維生素E):東京化成工業(yè)株式會(huì)社;沒(méi)食子酸、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、高丁香酸、香草醛、對(duì)香豆酸、阿魏酸:成都瑞芬思生物科技有限公司(純度>98%);甲醇、乙腈(色譜純):TEDIA 公司;其他試劑:廣州化學(xué)試劑廠。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FSH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機(jī):江蘇常州國(guó)旺儀器制造有限公司;IKA-RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:德國(guó)IKA有限公司;723可見(jiàn)光分光光度計(jì):上海奧譜勒有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀:安捷倫科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 游離酚的提取

    游離酚提取參照Wolfe等[11]的方法:挑選成熟度一致水果,自來(lái)水洗凈后用蒸餾水沖洗一遍。取水果可食用部分,25 g(3個(gè)平行)加入100 mL預(yù)冷的80%丙酮,均質(zhì)機(jī)均質(zhì)提取6 min(3.0 min×2停頓30 s),紗布過(guò)濾,果渣復(fù)提1次,合并濾液,45℃真空濃縮后用蒸餾水定容至25 mL,-80℃冰箱保存待測(cè)。

    1.3.2 結(jié)合酚的提取

    結(jié)合酚的提取采用NaOH消化法,參照Lin等[12]的方法。將1.3.1中提取殘?jiān)秒p蒸水除去有機(jī)試劑,加入 4 mol/L NaOH(1 g∶15 mL),室溫磁力攪拌提取2.0 h后用4 mol/L鹽酸調(diào)整pH值至2.0。乙酸乙酯萃取5次,合并萃取液,45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用甲醇定容后儲(chǔ)存于-80℃冰箱待測(cè)。

    1.3.3 多酚含量的測(cè)定

    參照Wolfe等[11]的方法,取125 μL稀釋至一定濃度的提取物,加入0.5 mL去離子水和125 μL的Folin-Ciocalteu試劑,混勻后反應(yīng) 6 min,再加入1.25 mL 7%Na2CO3溶液和1 mL蒸餾水,混勻,避光反應(yīng)90 min后于760 nm測(cè)定其吸光值,空白使用125 μL溶劑代替提取物。結(jié)果以每100克新鮮果肉所含的沒(méi)食子酸當(dāng)量表示(mg GAE/100 g FW)。

    1.3.4 單體酚類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定

    單體酚色譜條件參照Subba等[13]方法并稍作修改,色譜柱型ZorbaxSB-C18(4.6mm×250mm,5.0μm);流動(dòng)相 A:0.4%冰醋酸,B:乙腈;流速 1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;梯度洗脫程序:0~40 min B 5%~35%;40 min~45 min ,B 35%~50%;45 min~50 min,B 50%~80%。進(jìn)樣量5.0 μL。將不同濃度的混標(biāo)按照上述色譜條件進(jìn)行分析,根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性,采用峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量。以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中目標(biāo)物質(zhì)含量。

    1.3.5 水果提取物抗氧化活性

    1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

    參照Ma等[14]的方法并略作修改,取0.2 mL稀釋到一定濃度的樣品,加入2 mL去離子和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH自由基醇溶液,室溫避光反應(yīng)30 min后于517 nm處測(cè)定吸光度,空白用蒸餾水代替。結(jié)果以每100克鮮重中Trolox當(dāng)量(μmol TE/100 g FW)表示結(jié)果。

    1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

    采用張金宏[15]的方法。配制7.0 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液,140 mmol/L K2S2O8溶液。取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 μL 140 mmol/L K2S2O8溶液于離心管中,混勻,室溫下避光反應(yīng)12 h即為ABTS工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用),將ABTS工作液在734 nm處的吸光度用無(wú)水乙醇調(diào)整到0.700±0.020后備用。取25 μL稀釋至一定濃度的樣品加入2 mL ABTS工作液,混勻后室溫避光反應(yīng)6 min,于734 nm處測(cè)定吸光值。結(jié)果以每100克鮮重中Trolox當(dāng)量(μmol TE/100 g FW)表示。

    1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

    數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)運(yùn)用DPS統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA(以p<0.05為差異顯著)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 游離酚與結(jié)合酚含量

    游離酚與結(jié)合酚含量見(jiàn)圖1。

    6種水果提取物中的游離酚如圖1(a)所示,不同的水果之間多酚的含量差異較大,變異系數(shù)為74.32%。其中游離酚含量由高到低依次為楊桃[(342.85±8.38)mgGAE/100 g FW]、番石榴[(282.69±1.41)mg GAE/100 g FW]、荔枝[(91.82±2.09)mg GAE/100 g FW]、檸檬[(88.00±1.67)mg GAE/100 g FW]、龍眼[(85.13±0.51)mg GAE/100 g FW]、芒果[(36.20±0.37)mg GAE/100 g FW]。其中楊桃的游離酚含量是芒果的9.47倍。

    圖1 6種熱帶水果的游離酚和結(jié)合酚含量Fig.1 Free and bound phenolics content in six tropical fruits

    6種水果結(jié)合酚[圖1(b)]由高到低依次為楊桃[(23.19±2.52)mg GAE/100 g FW]、番石榴[(16.42±1.19)mg GAE/100 g FW]、荔枝[(3.82±0.99)mg GAE/100 g FW]、龍眼[(1.16±0.29)mg GAE/100 g FW]、檸檬[(0.92±0.06)mg GAE/100 g FW]、芒果[(0.80±0.10)mg GAE/100 g FW],楊桃與番石榴顯著高于其他 4 種水果(p<0.05),荔枝、龍眼、檸檬、芒果結(jié)合酚含量無(wú)顯著差異(p>0.05)。

    本文楊桃游離酚的含量與李群梅等報(bào)道[16]的不同品種楊桃游離酚含量(285 mg GAE/100 g FW~672 mg GAE/100 g FW)相當(dāng),結(jié)合酚的含量略高于Pang等的報(bào)道[17](6.4 mg GAE/100 g FW~19.7 mg GAE/100 g FW)。荔枝游離酚和結(jié)合酚的含量低于Su等的報(bào)道[18]。番石榴游離酚的含量高于李武等的報(bào)道[(192.46±6.17)mg GAE/100 g FW][19]。芒果和檸檬的游離酚含量略低于早期的報(bào)道[19-20],目前未見(jiàn)芒果和檸檬結(jié)合酚含量的報(bào)道。早期的研究發(fā)現(xiàn),水果的產(chǎn)地、品種對(duì)其多酚含量具有顯著的影響[20]。本文水果多酚的含量與文獻(xiàn)報(bào)道存在一定差異,可能與提取溶劑、水果的產(chǎn)地、品種等因素有關(guān)。

    2.2 單體酚組成分析

    6種熱帶水果游離酚的組成和含量如表1所示。結(jié)果顯示,番石榴主要含有鞣花酸、沒(méi)食子酸和苯甲酸;楊桃主要含有蘆丁、苯甲酸和鞣花酸,荔枝主要含有沒(méi)食子酸和蘆丁,龍眼主要含有沒(méi)食子酸和高香草酸,檸檬主要含有蘆丁、高香草酸、沒(méi)食子酸和香草酸。其中,楊桃的苯甲酸、鞣花酸和阿魏酸的含量顯著高于其他5種水果;龍眼的沒(méi)食子酸的含量顯著高于其他5種水果;檸檬的蘆丁、高香草酸和香草酸的含量相對(duì)較高。

    表1 6種水果游離酚中主要單體酚組成與含量Table 1 Quantification of the individual free phenolics in six fruits mg/100 g FW

    本文番石榴、楊桃和荔枝單體酚組成和含量的結(jié)果與其他研究者的報(bào)道相近[17-18,21-22]。對(duì)比前期的報(bào)道[21,23],本文首次在龍眼中檢測(cè)到丁香酸;在芒果中檢測(cè)到對(duì)香豆酸和香草酸。

    6種熱帶水果結(jié)合酚的組成和含量如表2所示。番石榴結(jié)合酚中主要含有蘆丁、鞣花酸、苯甲酸和香草酸,且均顯著高于其他5種水果(p<0.05)。與游離酚相比,番石榴結(jié)合酚中的香草酸、對(duì)香豆酸、蘆丁的含量增加了3.47倍~8.00倍;楊桃結(jié)合酚中的原兒茶酸的含量增加了4.39倍,且顯著高于其他5種水果(p<0.05)。與游離酚相比,在4種水果的結(jié)合酚中檢測(cè)到新的酚類(lèi)組分,荔枝中檢測(cè)到槲皮素和苯甲酸;龍眼中檢測(cè)到苯甲酸;芒果中檢測(cè)到鞣花酸;檸檬中檢測(cè)到對(duì)香豆酸和鞣花酸。本文荔枝槲皮素含量的結(jié)果與Su等的報(bào)道[18]相一致,對(duì)其他5種水果結(jié)合酚的組成還鮮有報(bào)道。

    表2 6種水果結(jié)合酚中主要單體酚組成與含量Table 2 Quantification of the individual bound phenolics in six fruits mg/100 g FW

    2.3 抗氧化能力

    6種水果游離酚與結(jié)合酚提取物的清除DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖2。

    圖2 6種水果游離酚與結(jié)合酚提取物的清除DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of free and bound phenolic extracted from six fruits

    如圖2(a)所示,6種水果游離酚提取物的DPPH自由基抗氧化值的變幅在261.07μmolTE/100gFW至3561.12μmolTE/100gFW之間,變異系數(shù)為104.81%。由高到低依次為楊桃(3 561.12±26.59)μmol TE/100 g FW、番石榴(3 471.72±25.17)μmol TE/100 g FW、荔枝(492.05±7.13)μmol TE/100 g FW、檸檬(375.07±11.03)μmol TE/100 g FW、龍眼(345.01±1.27)μmol TE/100 g FW、芒果(261.07± 2.72)μmol TE/100 g FW。其中,最高楊桃的DPPH自由基抗氧化值是芒果的13.64倍,檸檬與龍眼的抗氧化值無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

    6種水果結(jié)合酚[如圖2(b)]提取物的DPPH自由基抗氧化值由高到低依次為楊桃(110.90±1.88)μmol TE/100 g FW、番石榴(61.08±2.46)μmol TE/100 g FW、荔枝(17.42±2.15)μmol TE/100 g FW、龍眼(6.34±1.14)μmolTE/100gFW、檸檬(4.59±1.22)μmol TE/100 g FW、芒果(4.59±0.24)μmol TE/100 g FW。其中,最高楊桃的DPPH自由基抗氧化值是最低芒果的24.16倍。

    6種水果游離與結(jié)合酚提取物的清除ABTS+自由基能力見(jiàn)圖3。

    圖3 6種水果游離與結(jié)合酚提取物的清除ABTS+自由基能力Fig.3 ABTS+radical scavenging activity of free and bound phenolics extracted from six fruits

    如圖3(a)所示,6種水果游離酚提取物的ABTS+自由基抗氧化值抗氧化值的變幅在48.74 μmol TE/100 g FW至240.72 μmol TE/100 g FW之間,變異系數(shù)為64.96%。由高到低依次為楊桃(240.72±10.21)μmol TE/100 g FW、番石榴(217.39±1.57)μmol TE/100 g FW、荔枝(87.50±6.16)μmol TE/100 g FW、龍眼(80.29±2.12)μmol TE/100 g FW、芒果(48.91±6.28)μmol TE/100 g FW、檸檬(48.74±1.02)μmol TE/100 g FW。其中,荔枝與龍眼以及芒果與檸檬之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。

    如圖3(b)所示,結(jié)合酚提取物的ABTS+自由基抗氧化值由高到低依次為楊桃(135.87±1.81)μmol TE/100 g FW、番石榴(93.87±6.68)μmol TE/100 g FW、荔枝(19.75±3.67)μmol TE/100 g FW、龍眼(5.66±1.48)μmol TE/100 g FW、芒果(4.83±0.12)μmol TE/100 g FW、檸檬(2.22±0.07)μmol TE/100 g FW。

    比較兩種抗氧化測(cè)定方法的結(jié)果顯示,龍眼、芒果和檸檬抗氧化活性的相對(duì)強(qiáng)弱在不同測(cè)定方法中存在一定的差異,這一結(jié)果與趙謀明等的報(bào)道[21]相一致。多酚提取物的抗氧化活性在不同測(cè)定方法中呈現(xiàn)的差異性,可能與方法的測(cè)定原理以及樣品所含酚類(lèi)物質(zhì)的組成不同有關(guān)[24-25]。

    3 結(jié)論

    6種水果的游離酚含量為36.20 mg GAE/100 g FW~342.85 mg GAE/100 g FW,結(jié)合酚的含量為0.80 mg GAE/100 g FW~23.19 mg GAE/100 g FW;楊桃游離酚主要含有蘆丁[(8.74±0.90)mg/100 g FW]、苯甲酸[(6.63±0.48)mg/100 g FW]、鞣花酸[(4.47±0.10)mg/100 g FW],結(jié)合酚主要含有原兒茶酸[(3.07±0.50)mg/100 g FW];番石榴游離酚主要含有鞣花酸[(1.57±0.30)mg/100 g FW]、沒(méi)食子酸[(1.53±0.42)mg/100gFW]、苯甲酸[(1.39±0.10)mg/100gFW],結(jié)合酚主要含有鞣花酸[(1.69±0.14)mg/100 g FW]、苯甲酸[(1.44±0.10)mg/100 g FW]、香草酸[(1.44±0.13)mg/100 g FW];荔枝游離酚主要含有沒(méi)食子酸[(5.18±0.04)mg/100gFW]、蘆丁[(3.09±0.72)mg/100gFW],結(jié)合酚主要含有原兒茶酸[(0.39±0.15)mg/100gFW];龍眼游離酚主要含有沒(méi)食子酸[(10.71±0.37)mg/100 g FW]、高香草酸[(2.04±0.01)mg/100 g FW],結(jié)合酚主要含有鞣花酸[(0.44±0.03)mg/100 g FW];檸檬游離酚主要含有蘆丁[(9.34±0.43)mg/100 g FW]、高香草酸[(6.65±0.35)mg/100g FW]、沒(méi)食子酸[(6.29±0.20)mg/100 g FW];芒果游離酚主要含有沒(méi)食子酸[(3.23±0.63)mg/100 g FW]、苯甲酸[(1.45±0.47)mg/100 g FW],結(jié)合酚主要含有鞣花酸[(0.16±0.01)mg/100gFW]。6種水果游離酚和結(jié)合酚的DPPH自由基清除能力分別為261.07 μmol TE/100 g FW~3561.12μmolTE/100gFW 和 4.59 μmolTE/100gFW~110.90μmolTE/100gFW;ABTS+自由基清除能力分別為 48.74 μmolTE/100gFW~240.72μmolTE/100gFW和2.22μmolTE/100gFW~135.87μmolTE/100gFW。

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