不同白油佐劑制備的H9N2滅活疫苗在SPF雞上的免疫效果初試驗(yàn)

王友令 袁小遠(yuǎn) 孟凱 徐懷英 張玉霞 李莉 亓麗紅 宋敏訓(xùn) 艾武（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東 濟(jì)南 250100）

?

不同白油佐劑制備的H9N2滅活疫苗在SPF雞上的免疫效果初試驗(yàn)

王友令 袁小遠(yuǎn) 孟凱 徐懷英 張玉霞 李莉 亓麗紅 宋敏訓(xùn) 艾武*（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東 濟(jì)南 250100）

為了比較不同廠(chǎng)家的注射用礦物白油佐劑的免疫效果，試驗(yàn)采用3個(gè)不同黏度的國(guó)外白油樣品，按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》進(jìn)行注射用白油質(zhì)量檢驗(yàn)、制備3批H9N2油乳劑滅活疫苗，分別以0.3ml/只劑量，胸部肌肉注射接種28日齡SPF雞，接種后14d、21d、28d、35d、42d分別進(jìn)行疫苗的藥物殘留吸收檢查和血清抗體效價(jià)檢測(cè)。結(jié)果表明：3種佐劑疫苗的安全性、穩(wěn)定性均良好；應(yīng)用WG40白油佐劑的滅活疫苗，免疫SPF雞產(chǎn)生的H9N2禽流感HI抗體水平優(yōu)于其它兩種佐劑，免疫3周后檢測(cè)到的H9N2禽流感抗體水平均合格，WG40確定為最佳白油佐劑。

礦物白油佐劑 運(yùn)動(dòng)黏度 H9N2 免疫效果

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)感染禽類(lèi)后引起的一種疾病綜合癥，包括呼吸道、消化道、產(chǎn)蛋量下降或免疫抑制等疾病，可分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無(wú)致病性禽流感三類(lèi)[1]。我國(guó)自1994年首次在廣東省分離到H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza viruses, H9N2 subtype AIV)以來(lái)，H9N2亞型禽流感病毒仍是當(dāng)前我國(guó)雞群中的主要的低致病性禽流感亞型。H9N2亞型禽流感病毒給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的危害，該病毒不但造成禽呼吸道疾病，還侵害家禽的生殖系統(tǒng)，造成蛋禽產(chǎn)蛋率下降，肉禽生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)易與其他病原微生物混合感染，造成死亡， H9N2亞型禽流感病毒已經(jīng)有廣泛的宿主范圍，包括人類(lèi)、豬以及家禽[2]。最近在中國(guó)H7N9高致病性禽流感的暴發(fā)導(dǎo)致了多人死亡，其中H7N9毒株的六個(gè)內(nèi)部基因(PA、NS、PB2、PB1、NP、M)均來(lái)自H9N2亞型禽流感病毒[3]。此外，有報(bào)道稱(chēng)國(guó)內(nèi)貓和犬也易感H9N2亞型禽流感，由于這些物種在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家與人類(lèi)有更親近的關(guān)系，可能會(huì)對(duì)人的健康造成更大的風(fēng)險(xiǎn)，H9N2亞型禽流感將成為人畜共患傳染病毒的儲(chǔ)蓄庫(kù)[4]。預(yù)防和控制禽流感最有效的手段就是免疫接種，目前我國(guó)用于禽流感H9N2防控的疫苗多為滅活疫苗，所采用的佐劑多數(shù)為注射用礦物白油佐劑，油乳劑滅活疫苗由于其具有完整的免疫原性和無(wú)毒力返祖現(xiàn)象，并且具有免疫效力高，使用安全，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，受到了廣大養(yǎng)殖戶(hù)的青睞。因此，注射用礦物白油作為一種佐劑被廣泛地應(yīng)用于禽用滅活疫苗生產(chǎn)中。但不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的注射用白油佐劑黏度和純度等質(zhì)量不一，因而其應(yīng)激、免疫吸收和抗體消長(zhǎng)效果差異較大，直接影響著疫苗的免疫效果[5,6]。本試驗(yàn)選擇3個(gè)不同廠(chǎng)家注射用礦物白油佐劑樣品，嚴(yán)格按照油乳劑滅活疫苗制造與檢驗(yàn)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行H9N2滅活疫苗的制備與檢驗(yàn)[7]。將檢驗(yàn)合格的不同廠(chǎng)家注射用礦物白油佐劑滅活疫苗進(jìn)行SPF雞免疫效果試驗(yàn)，對(duì)免疫雞進(jìn)行采血分離血清檢測(cè)抗體效價(jià)，同時(shí)剖檢觀察注射部位藥物吸收、殘留情況，通過(guò)比較不同廠(chǎng)家注射用礦物白油佐劑的免疫效果差異，為獸醫(yī)生物制品行業(yè)選用合適的礦物白油提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 礦物白油佐劑 不同廠(chǎng)家注射用白油型號(hào)分別為WG40、WG50、DDE170，由國(guó)內(nèi)兩家不同代理商提供。

1.2 病毒滅活液與標(biāo)準(zhǔn)血清 各項(xiàng)檢驗(yàn)合格的雞H9N2病毒滅活液由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所無(wú)特定病原雞研究室提供。標(biāo)準(zhǔn)H9N2陽(yáng)性抗原、標(biāo)準(zhǔn)H9N2陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3 培養(yǎng)基和藥品 需氧菌培養(yǎng)基、厭氧菌培養(yǎng)基、霉菌培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所制備和保存；吐溫-80、司本-80由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司提供。

1.4 試驗(yàn)材料及設(shè)備 28日齡SPF雞，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所無(wú)特定病原雞研究室提供。FA25型剪切機(jī)，上海弗魯克公司生產(chǎn)。禽用負(fù)壓隔離器，蘇州安泰公司生產(chǎn)。

1.5 不同廠(chǎng)家注射用礦物白油質(zhì)量檢測(cè) 相對(duì)密度、運(yùn)動(dòng)黏度、稠環(huán)芳烴、重金屬含量按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010版)的相關(guān)規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)[8]。

1.6 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗制備與檢驗(yàn) 按照油乳劑滅活疫苗的相關(guān)規(guī)定方法進(jìn)行制備與檢驗(yàn)[9]，每個(gè)白油樣品制備油乳劑滅活疫苗各250ml。

1.7 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫效果試驗(yàn) 每個(gè)白油樣品H9N2油乳劑滅活疫苗分別以0.3ml/只劑量，胸部肌肉注射接種28日齡SPF雞30只，于接種后14d、21d、28d、35d、42d分別無(wú)菌采血10只雞進(jìn)行血清抗體(HI)效價(jià)檢測(cè)。同時(shí)每組撲殺5只雞進(jìn)行疫苗的藥物殘留吸收檢查。采用SPSS11.5軟件和GraphPad Prism 5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射礦物白油質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 不同廠(chǎng)家注射用礦物白油質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目與數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同廠(chǎng)家注射用礦物白油質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，對(duì)照《中華人民共和國(guó)獸藥典》的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：運(yùn)動(dòng)黏度<7.0的是礦物白油WG40；3種白油稠環(huán)芳烴含量吸光度均小于0.10；重金屬含量3種白油均<10。

2.2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗的檢驗(yàn)結(jié)果 3種注射用礦物白油佐劑配制的H9N2滅活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果：物理性狀檢驗(yàn)合格；疫苗黏度分別是WG40為1.7s、WG50為2.3s、DDE170為2.5s；無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均合格。

2.3 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫 藥物吸收、殘留剖檢結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗胸部肌肉注射藥物吸收、殘留剖檢結(jié)果

白油組別14d21d28d35d42d WG402/5+,3/5++5/5+1/5-,4/5+2/5-,3/5+4/5-,1/5+ WG505/5++5/5+3/5-,2/5+4/5-,1/5+4/5-,1/5+ DDE1701/5+,4/5++-1/5,4/5+2/5-,3/5+3/5-,2/5+3/5-,2/5+

注：(-)吸收好無(wú)殘留物痕跡；(+)藥物殘留為少量的針尖狀的乳白色細(xì)小顆粒；(++)藥物殘留為小米粒樣的乳白色顆粒、有綠豆粒大小的肉芽腫1~2 個(gè)。

由表2可知，經(jīng)過(guò)5次注射部位剖檢檢查藥物殘留情況綜合統(tǒng)計(jì)，結(jié)果其白油佐劑吸收較好的順序是：WG40>WG50>DDE170。

2.4 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫HI抗體檢測(cè)結(jié)果 將5次血清抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)分析處理，其抗體消長(zhǎng)情況見(jiàn)附圖。

附圖 不同礦物白油H9N2滅活疫苗免疫抗體消長(zhǎng)曲線(xiàn)

由附圖可知：不同礦物白油樣品H9N2滅活疫苗抗體監(jiān)測(cè)平均值比較發(fā)現(xiàn)，WG40在接種后14d、21d、28d、35d、42d的抗體均比WG50和DDE170高，且抗體上升快。而WG50和DDE170組在整個(gè)免疫期抗體差異不大，從抗體水平看，WG40白油適合用于H9N2油乳劑疫苗的佐劑。

3 討論

（1）免疫佐劑是指與抗原同時(shí)或先于抗原使用，能增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類(lèi)型的物質(zhì)[10]。選擇佐劑時(shí)不僅要考慮其免疫促進(jìn)作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當(dāng)比例配制后疫苗的黏度、穩(wěn)定性等是否符合要求。目前，滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，通常使用的佐劑是礦物油佐劑，抗體滴度維持時(shí)間較長(zhǎng)。但是，不同油佐劑對(duì)疫苗免疫效果的增強(qiáng)作用可能存在差異[11]。礦物白油佐劑在獸用滅活疫苗上的應(yīng)用研究開(kāi)始于上世紀(jì)80年代，對(duì)預(yù)防控制畜禽重大疫病的傳播起到重要作用[12]。注射用礦物白油，其配制的滅活疫苗的共性問(wèn)題是：如果注射用礦物白油的運(yùn)動(dòng)黏度系數(shù)高，則制備的滅活疫苗在免疫注射過(guò)程中出現(xiàn)黏稠度較大、注射困難、毒副反應(yīng)較強(qiáng)(過(guò)敏)、引起注射部位紅腫、化膿、吸收慢、殘留量高，導(dǎo)致免疫動(dòng)物生產(chǎn)和生長(zhǎng)發(fā)育性能顯著下降等現(xiàn)象；運(yùn)動(dòng)黏度系數(shù)過(guò)低，則制備的滅活疫苗在免疫注射過(guò)程中出現(xiàn)黏稠度較小、吸收過(guò)快、毒副反應(yīng)較強(qiáng)(過(guò)敏)，黏度過(guò)高過(guò)低均會(huì)引起大的應(yīng)激問(wèn)題，其本質(zhì)與礦物白油佐劑的內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)[13]。（2）本試驗(yàn)選擇了3種進(jìn)口油佐劑，與禽流感( H9N2亞型) 病毒液配制成滅活疫苗，免疫接種28日齡的SPF雞均未出現(xiàn)局部腫塊及不良反應(yīng)，說(shuō)明3 種佐劑的生物兼容性較好，易吸收，無(wú)毒副作用。通過(guò)對(duì)這3種注射用礦物白油樣品質(zhì)量監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)、抗體消長(zhǎng)數(shù)據(jù)、藥物吸收及殘留量檢測(cè)等結(jié)果綜合分析，表明，影響免疫效果的是注射用礦物白油的運(yùn)動(dòng)黏度、稠環(huán)芳烴含量、重金屬含量等綜合因素。根據(jù)本試驗(yàn)研究的3種進(jìn)口油佐劑配制的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗免疫28日齡SPF雞的效力檢驗(yàn)結(jié)果表明，不同佐劑制備的滅活疫苗的抗體效價(jià)確實(shí)存在明顯差異，只有WG40作為佐劑的疫苗，免疫后2周H9N2流感病毒的抗體達(dá)到合格水平，其余佐劑則在免疫3周后才能達(dá)到合格水平。分析原因，這可能與其運(yùn)動(dòng)黏度較低，抗原能夠短時(shí)間釋放有一定的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為WG40白油可以作為30日齡左右育成雞的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗的理想佐劑，但是以WG40為佐劑的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗在產(chǎn)蛋禽上的實(shí)際應(yīng)用效果有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] Wan Z, Ye J, Sang J, et al. Identification of amino acids in H9N2 influenza virus neuraminidase that are critical for the binding of two mouse monoclonal antibodies [J]. Veterinary microbiology, 2016, 187: 58-63.

[2] Butt K M, Smith G J D, Chen H, et al. Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J]. Journal of clinical microbiology, 2005, 43(11): 5760-5767.

[3] Lam T T Y, Wang J, Shen Y, et al. The genesis and source of the H7N9 influenza viruses causing human infections in China [J]. Nature, 2013, 502(7470): 241-244.

[4] Zhang K, Zhang Z, Yu Z, et al. Domestic cats and dogs are susceptible to H9N2 avian influenza virus[J]. Virus research, 2013, 175(1): 52-57.

[5] 李明義, 范根成, 杜元釗等. 禽流感(H5、H9亞型)二價(jià)油乳劑滅活疫苗試驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2005, 22(4): 22-24.

[6] 白軍, 劉淑紅. H9亞型禽流感疫苗研究進(jìn)展[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2016(11):102-103.

[7] 喬榮岑, 習(xí)向鋒, 孫進(jìn)忠等. 雞新城疫、H9亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的制備方法[P]. CN101607084. 2009.

[8] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典: 2010年版[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011.

[9] 沈克飛, 曹蘭, 尹繼剛等. 免疫佐劑研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007, 28(s1):34-36.

[10] 王振輝, 慈洪波, 武桂梅等. 不同來(lái)源注射用白油佐劑免疫效果分析[J]. 中國(guó)家禽, 2013, 35(19):48-50.

[11] 段龍, 李學(xué)釗, 田啟會(huì). 常用新城疫疫苗免疫佐劑的篩選[J]. 中國(guó)家禽, 2015, 37(14): 65-66.

[12] 何海蓉, 姜平, 梅忠等. 不同來(lái)源白油佐劑質(zhì)量分析及其制備的禽流感疫苗安全性與免疫效力研究[J]. 中國(guó)家禽, 2009, 31(22): 15-18.

[13] 陳紅秀, 魏延宏, 朱秀同. 不同油佐劑制備的禽流感疫苗對(duì)肉雞安全性和免疫效力研究[C]. 中國(guó)獸藥大會(huì). 2014.

（2017–09–28）

畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)(2016YFD0501600)；山東省2015年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(肉鴨疫病監(jiān)測(cè)和防治技術(shù)集成與示范)；山東省中標(biāo)禽流感疫苗質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目。

S859.79+7

A

1007-1733(2018)02-0003-03