融合表達(dá)抗菌肽和IL基因的重組酵母制劑對仔豬生長和免疫的調(diào)節(jié)效應(yīng)

黎 凌，胡立博，吳雪穎，馬?？。f小平，肖永樂，梁 歌，曾 凱，李江淩，呂學(xué)斌，王澤洲,高 榮?

（1.生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室動物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)試驗(yàn)室四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064;2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066;3.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610035）

隨著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的集約化發(fā)展，疾病已成為困擾養(yǎng)豬業(yè)的最大問題。目前，疫苗是預(yù)防和控制豬類傳染病發(fā)病率與傳播的主要手段。近年來疫苗防治收到了一定的效果[1]，但由于多方面的原因，免疫失效現(xiàn)象也時(shí)常發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的健康衛(wèi)生問題[2-3]。因此，預(yù)防和控制豬類傳染病，不能僅僅依靠常規(guī)的免疫接種，研制一種能有效提高仔豬綜合免疫力的新型免疫制劑是可行的措施[4]。

白細(xì)胞介素（IL）是由白細(xì)胞或免疫細(xì)胞產(chǎn)生，并在細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，它與血細(xì)胞生長因子均屬于細(xì)胞因子[5]。兩種因子相互影響，共同發(fā)揮造血和免疫調(diào)節(jié)作用[6-8]。白細(xì)胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。IL-2的生物學(xué)功能相當(dāng)廣泛，它對多種細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均能產(chǎn)生一定作用，包括刺激活性B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，刺激B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞等，尤其是對于T細(xì)胞生長的影響極為顯著[9-10]。它是體液免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。IL-4對于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造血細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用[11]，能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)換向IgE，促進(jìn)MHC II類表達(dá)[12]。它對體液免疫和適應(yīng)性免疫也具有調(diào)節(jié)作用。IL-6兼有促炎和抗炎的特性，是介導(dǎo)人體發(fā)熱和急性期反應(yīng)的重要媒介之一[13]。它能夠跨越血腦屏障，在下丘腦引發(fā)合成PGE2，從而改變溫度設(shè)定值[14]。在肌肉和脂肪組織中，IL-6能夠刺激能量調(diào)動，從而升高體溫。

抗菌肽是一種具有生物活性的小分子多肽，也是先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[15]。它不但具有廣譜抗菌作用,對于真菌、病毒、寄生蟲等也具有一定的殺傷能力[16-17]。同時(shí)抗菌肽具有抑制腫瘤細(xì)胞、中和內(nèi)毒素、提高免疫力、加速傷口愈合等諸多生物學(xué)功能。它們還可以通過趨化樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和記憶T細(xì)胞,在先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)之間起橋梁作用[18-19]。其抗菌活性高，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等優(yōu)勢使得抗菌肽在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[20-21]。

酵母菌品種多、分布廣、生長快、代謝旺盛，又具有耐溫、耐酸性、耐高滲透壓、耐高濃度有機(jī)底物及分解有毒物質(zhì)等特性[22]，同時(shí)酵母菌菌體蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)成分與活性物質(zhì)種類豐富[23-24]，并且酵母細(xì)胞還具有高等細(xì)胞高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多特點(diǎn)。重組酵母可用于表達(dá)細(xì)胞因子基因，通過口服接種的方式有效提高動物免疫力[25]。

我們以往的研究表明，融合表達(dá)豬IL-2和IL-4/6基因可有效提高對病原菌感染的抗性，通過口服可引起局部和全身的免疫反應(yīng)[26-28]。本實(shí)驗(yàn)室在以往的試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了融合表達(dá)豬IL-2基因與IL-4/6基因、融合表達(dá)豬IL-4/6基因和牛源抗菌肽的兩種重組畢赤酵母，以研究其對仔豬生長和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 重組畢赤酵母的構(gòu)建重組豬IL-2、4/6（SG246）和豬IL4/6與牛源抗菌肽重組畢赤酵母SMD1168酵母菌（SG46B），本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 重組畢赤酵母的發(fā)酵本試驗(yàn)所用發(fā)酵制劑均是在100 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵所得。

1.2.1 種子的活化與制備 解凍保存的兩種重組畢赤酵母和空白對照畢赤酵母，取90 μL加入3 mL酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）種子培養(yǎng)基，30℃，200 r/min，于搖床上培養(yǎng)14 h左右以便活化菌種。待菌液在600 nm波長處的吸光值（OD600）約為6，取30 μL重組酵母細(xì)胞培養(yǎng)液接種到3 mL YPD一級種子培養(yǎng)基，并加入300 μg博來霉素，30℃，200 r/min，于搖床上培養(yǎng)10 h左右制備一級種子。將一級種子接入30 mL YPD二級種子培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，于搖床上培養(yǎng)10 h左右制備二級種子。將二級種子分3份，分別接入3個1 L YPD三級種子培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，于搖床上培養(yǎng)10 h左右制備三級種子。分別制備3種畢赤酵母的三級種子。

1.2.2 畢赤酵母的高密度發(fā)酵 將1 L搖好的種子加入含有35 L優(yōu)化BSM發(fā)酵培養(yǎng)基（具體成分如表1和表2所示）的100 L發(fā)酵罐中。按照下列條件進(jìn)行高密度發(fā)酵：30℃，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min，調(diào)整攪拌和通氣速率以控制溶解氧（DO）維持在20%～30%水平，添加氨水（28%）維持pH在6.0左右、添加GPE型聚醚類消泡劑控制氣泡產(chǎn)生。在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)測量OD600的值，從而控制酵母生長。發(fā)酵結(jié)束后，添加殼聚糖濃度為0.3 mg/mL絮凝劑至發(fā)酵液中絮凝酵母。

表1 優(yōu)化的BSM培養(yǎng)基組成成分Table 1 Compositions of modified BSM medium

表2 PTM1（微量元素）組成成分Table 2 Compositions of PMT1 trace salts

3種畢赤酵母各發(fā)酵1次，每次發(fā)酵35 L，試驗(yàn)中的所有發(fā)酵條件均于上述條件一致。

1.3 仔豬分組及飼喂此次試驗(yàn)選用28頭體重約為7 kg的45日齡健康杜大長雜交仔豬，隨機(jī)分為3組，兩個試驗(yàn)組：A1組10頭，A2組10頭，以及一個對照組：C組8頭。整個試驗(yàn)期間，所有仔豬所飼喂的飼料以及所接受的常規(guī)免疫疫苗均相同，21日齡時(shí)分別肌肉注射豬瘟弱毒疫苗和藍(lán)耳病滅活苗（成都藥械廠生產(chǎn)）常規(guī)免疫；飼喂環(huán)境皆一致；試驗(yàn)組分別飼喂對應(yīng)的A1、A2兩種重組畢赤酵母發(fā)酵液，連續(xù)飼喂4周；對照組C組飼喂重組畢赤酵母發(fā)酵液，連續(xù)飼喂4周。重組畢赤酵母發(fā)酵液飼喂前需先搖勻，具體用量及安排列于表3。

1.4 試驗(yàn)仔豬體重變化試驗(yàn)的第0、14、28和42天，在相同的稱量條件下，測定各組仔豬的總體重，并記錄試驗(yàn)期間每組的飼料消耗量。計(jì)算3組仔豬的平均增重、凈增重與各組的料重比，以評價(jià)2種不同的重組畢赤酵母制劑對仔豬生長方面的影響。

1.5 試驗(yàn)仔豬外周血血樣采集試驗(yàn)的第0、7、14、28和42天，采取仔豬3～4 mL前腔靜脈血，用含有EDTA-K2的真空采血管收集血樣。用以評估兩種重組畢赤酵母制劑對仔豬免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

表3 動物試驗(yàn)分組及飼養(yǎng)方案Table 3 Animal experiment grouping and feeding scheme

1.6 試驗(yàn)仔豬外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的測定試驗(yàn)的第0、7、14、28和42天，每個組別取100μL所采集的仔豬血液樣品，用MIND-RAYBC-3000血細(xì)胞分析儀測定血樣中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白的數(shù)量。

1.7 試驗(yàn)仔豬外周血Th和Tc細(xì)胞數(shù)量的變化的測定小鼠抗豬CD3、CD4和CD8單克隆抗體分別由Southern Biotech的異硫氰酸熒光素（FITC）、R-藻紅蛋白（R-PE）和光譜紅（SPRD）（購自Southern Biotech公司）標(biāo)記。

試驗(yàn)的第0、7、14、28和42天，每個組別取50 μL所采集的仔豬混合血液樣品，加入等體積的生理鹽水，然后每個樣品添加1 μL FITC標(biāo)記的抗CD3，2 μL PE標(biāo)記的抗CD4和2 μL SPRD標(biāo)記的抗CD8，在黑暗中孵育20 min。完成孵化后，加入2 mL（10%V/V）紅細(xì)胞裂解液（購自Becton Dickinson公司）的混合物，充分混勻，裂解5 min以確保所有紅細(xì)胞完全裂解，1 500 r/min離心5 min，棄上清。最后，加入2 mL冷PBS重懸細(xì)胞，洗滌沉淀，1 500 r/mIN離心5 min，棄上清，共洗2次。完成洗滌后，加入150 μL PBS重懸細(xì)胞，并移入流式細(xì)胞儀試管中，待上機(jī)分析。

1.8 試驗(yàn)仔豬外周血中特異性抗體的檢測——ELI-SA選用豬瘟（CSF）抗體和豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）抗體ELISA試劑盒（上海艾麗莎生物科技有限公司提供），用于檢測血樣上清液中CSF抗體和PRRS抗體。每組每頭仔豬取2 mL采集好的全血血樣，離心20 min左右（2 000～3 000 r/min），仔細(xì)收集上清，-80℃保存，以測定CSF和PRRS抗體。按照試劑盒上的步驟進(jìn)行檢測分析。

1.9 熒光定量檢測免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)水平試驗(yàn)的第0、7、14、28和42天，每組每頭仔豬取100 μL采集好的全血血樣，加入900 μL RNAios plus，混合均勻，參照Takara RNAios plus說明書提取細(xì)胞總 RNA。取 3 μL RNA（RNA量在 50 ng～5μg之間）溶液，按照全式金One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用步驟，反轉(zhuǎn)合成cDNA。

選基因PPIA作為內(nèi)參基因（PPIA的Ct值為25左右）；選用表4所設(shè)計(jì)的引物作為免疫應(yīng)答相關(guān)基因的熒光定量檢測引物。

具體定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL、上下游引物0.5 μL、2X SsoFast EvaGreen SuperMix 7.5 μL、ddH2O 6μL，合計(jì)：15 μL 體系。所有成分均在低溫下添加，充分混勻并瞬離。

定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃3 min；95℃6 s、退火溫度9 s、72℃10 s，40個循環(huán)；72℃10 min；溶解曲線參數(shù)為：65～95℃，每10 s上升0.5℃。

以PPIA作為內(nèi)參基因，以對照組第一次樣品cDNA為校準(zhǔn)樣品，采用2-ΔΔCT[29]法分析定量后PCR數(shù)據(jù)，比較同一目的基因的表達(dá)水平在試驗(yàn)組和對照組之間的差異。1.10統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 6 Demo軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以P＜0.05為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對豬生長性能的影響2種重組酵母制劑對仔豬體重變化的影響圖1和圖2所示，兩種重組酵母制劑對料重比的影響如圖3所示。由圖1可以看出，A1和A2組每頭仔豬的平均體重均明顯升高（P＜0.05）且高于C組；由圖2可以看出，A1和A2組每頭仔豬的凈增重也高于對照組C（P＜0.05），尤其是在第42天，A1和A2組每頭仔豬的凈增重比對照組C的高出1.66 kg和3.47 kg；由圖3可以看出，A1料重比持續(xù)高于C組（P＜0.05），A2的料重比持續(xù)低于C組（P＜0.05）。結(jié)果表明，A1、A2兩種重組酵母制劑均可明顯促進(jìn)仔豬的生長，且A1制劑促進(jìn)仔豬生長效果優(yōu)于A2制劑。但A2制劑在降低料重比方面優(yōu)于A1制劑。

表4 定量引物的序列Table 4 Sequences of QPCR primers

圖1 試驗(yàn)仔豬的平均體重變化Fig.1 The average weight change of piglets

圖2 試驗(yàn)仔豬的平均凈增重量變化Fig.2 The average net weight change of piglets

圖3 試驗(yàn)仔豬的平均料重比變化Fig.3 The feed-gain ratio of piglets

2.2 外周血免疫細(xì)胞的變化從圖4可以看出，在A圖與C圖中，A1和A2組的紅細(xì)胞和血紅蛋白數(shù)量與C組無明顯差異（P＞0.05）。B圖中第14天到第28天，A1組的白細(xì)胞數(shù)量顯著增高（P＜0.05），且高于其他各組。

圖4 試驗(yàn)仔豬血液中免疫細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.4 The quantity change of immune cells in the blood of experimental piglets

2.3 外周血 T細(xì)胞的變化從圖5可以看出，在整個試驗(yàn)期間，A1、A2和C組的血樣中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量無明顯差異；但從第14天到第28天，在A1組的血樣中CD8+T細(xì)胞的比例比其他組高（P＜0.05）。

2.4 特異性抗體的變化從圖6可以看出，試驗(yàn)的第0天到第28天，A1和A2組血清中的CSF特異性抗體和PRRS特異性抗體對照組C明顯增加（P＜0.05）。在整個試驗(yàn)期間，C組血清中的CSF特異性抗體和PRRS特異性抗體沒有明顯改變（P＞0.05）。

2.5 免疫相關(guān)基因的變化

2.5.1 Toll樣受體（TLR）基因的變化圖7表明，從試驗(yàn)的第14天到第28天，A1組的TLR-2、TLR-4和TLR-7基因的表達(dá)水平均明顯高于C組（P＜0.05）；另外在接種后的第42天，A2組的4種TLR基因（TLR2，TLR4，TLR7，TLR9）的表達(dá)水平顯著高于A1組與C組（P＜0.05）。

圖5 試驗(yàn)仔豬血液中T細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.5 The change of T cells quantity in the peripheral blood of pigs.

圖6 試驗(yàn)仔豬血液中CSF特異性抗體和PRRS特異性抗體數(shù)量的變化Fig.6 the change of specific antibody to CSF and specific antibody to PRRS in serum

2.5.2 免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相關(guān)基因的變化 在試驗(yàn)期間，每組仔豬的血液樣本中4種免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相關(guān)基因的表達(dá)水平雖然有一些波動，但沒有明顯差異（P＞0.05）。不過從圖8的B、C和D圖中也可以看出，在試驗(yàn)的第42天，與A1組與C組相比，A2組STAT1、STAT3和NF-κB基因的表達(dá)水平更顯著（P＜0.05）。

2.5.3 免疫記憶相關(guān)基因的表達(dá)變化 如圖9所示，3組之間早期基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的規(guī)律（P＞0.05）。在試驗(yàn)的第42天，A1和A2組的CD45和CD62L基因的表達(dá)水平相比于C組更顯著（P＜0.05）。

3 討論

以往的研究表明，通過口服接種融合表達(dá)豬IL-2和IL-4/6基因的重組畢赤酵母，可以促進(jìn)仔豬生長并顯著的提高仔豬免疫力。同時(shí)，前期研究也表明，口服接種融合表達(dá)牛源抗菌肽和豬IL-4/6的重組畢赤酵母也可以顯著增強(qiáng)小鼠免疫應(yīng)答水平。本研究主要集中在評估融合表達(dá)牛源抗菌肽和豬IL-4/6的重組畢赤酵母是否可以通過口服接種來促進(jìn)仔豬生長和提高免疫應(yīng)答水平。

圖7 試驗(yàn)仔豬血液中TLR樣基因的表達(dá)水平變化Fig.7 The change of TLR genes in blood samples of experiment piglets

圖8 試驗(yàn)仔豬血液中免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相關(guān)基因的表達(dá)水平變化Fig.8 The change of the immune signal transduction molecules relative genes in blood samples of experiment piglets

圖9 試驗(yàn)仔豬血液中免疫記憶相關(guān)基因的表達(dá)水平變化Fig.9 The change of the immune memory relative genes expression in blood samples of experiment piglets

本次試驗(yàn)可以觀察到，融合表達(dá)豬IL-2和IL-4/6基因的重組畢赤酵母與融合表達(dá)牛源抗菌肽和豬IL-4/6的重組畢赤酵母相比于對照組均能有效促進(jìn)仔豬生長和提高免疫應(yīng)答水平

A1、A2組每頭仔豬平均體重較C組相比均明顯升高（P＜0.05），在試驗(yàn)的第42天，A1、A2組每頭仔豬的凈增重分別高出對照組C 3.47 kg和1.66 kg（P＜0.05）。有趣的是，A1的料重比均高于C組（P＜0.05），而A2的料重比均低于C組（P＜0.05）。血液中的A1和A2的CD8+T細(xì)胞的比例均高于C組（P＜0.05）。從試驗(yàn)的第0天到第28天，在A1和A2組的血清中CSF特異性抗體和PRRS特異性抗體的增加比對照C組更明顯（P＜0.05）。早期一些報(bào)道已表明，細(xì)胞因子不僅在細(xì)胞之間傳達(dá)信息，同時(shí)也調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程，提高機(jī)體的免疫力，而且影響生長和增重效率[30-31]?？咕木哂袕V譜抗菌活性，是生物先天性免疫的重要組成部分，同時(shí)，抗菌肽的適宜量能促進(jìn)生長[32]。因此，這些結(jié)果可能與融合基因的介導(dǎo)調(diào)控的有關(guān)。

在這個試驗(yàn)中，可以看到，在試驗(yàn)的第42天，A1組的大部分選定基因的表達(dá)水平與C組比較顯著升高，A2組的4種Toll樣受體（TLR2、TLR4、TLR7、TLR9）基因和部分重要的免疫相關(guān)基因如STAT1、STAT3、NF-κB、CD45和CD62L的表達(dá)水平與C組比較顯著升高。

TLR是先天免疫系統(tǒng)的組成部分，也是特異性免疫和非特異性免疫之間的橋梁[33]。STAT1基因編碼的蛋白質(zhì)參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制Bcl-2的表達(dá)。STAT3在調(diào)控細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移方面有重要作用[34]。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的重要基因，它和促凋亡因子Bax一起調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[35]。NF-κB能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，它與炎癥反應(yīng)，免疫反應(yīng)，細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡的病理生理過程密切相關(guān)[36]。CD45在免疫細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化中扮演著一個非常重要的角色[37]。CD62L屬于表面凝集素的一種，中性粒細(xì)胞的“滾動”以及炎癥過程中的初始與之密切相關(guān)[38]。這些均與免疫調(diào)節(jié)劑能增強(qiáng)仔豬免疫應(yīng)答水平相關(guān)。

簡而言之，本研究結(jié)果證試，融合表達(dá)牛源抗菌肽和豬IL-4/6的重組酵母能夠有效促進(jìn)仔豬的生長發(fā)育，并增強(qiáng)仔豬的免疫應(yīng)答水平，是一種經(jīng)濟(jì)試用安全的免疫生物調(diào)節(jié)劑。

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